国内外已成功开发多种表达系统，如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等表达系统，其关键起始原材料是遗传稳定的工程细胞/菌/毒株，重要评价指标之一外源基因稳定性 [1]。
《中国药典》2020版3部中《生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制》明确指出重组工程菌生产用菌种主种子批检定需进行外源基因拷贝数检定[2]，ICH Q5B要求采用限制性内切酶图谱或其他适宜的技术分析表达构建体的拷贝数、插入或缺失情况以及整合位点的数目；对染色体外的表达系统（如大肠杆菌），应测定保留有表达构星空体育 星空体育平台建体的宿主细胞所占的百分数[3]。因此，外源基因拷贝数检测对产品的质量控制及安全性具有重要意义。
现有的选择培养基平板复制法只能检测细胞中质粒保有率，不能检测质粒的拷贝数。而氯化铯-溴化乙锭平衡密度梯度离心法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、Southern blot法等传统方法普遍具有操作复杂、耗时耗力和重复性较差等缺点，因此，近年来兴起的实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）技术因快速灵敏、特异性强、高通量等优点被广泛应用于基因拷贝数的检测。
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
RT-qPCR法又分为SYBR Green I染料法和Taqman探针法。SYBR Green I能与所有双链DNA小沟结合，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号；而不掺入双链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
重要参数Ct值，也称循环阈值（Cycle threshold），指在PCR循环过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准样品可作出标准曲线。因此，只要获得待测样品的Ct值，就可以从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
在检测方法开发阶段，需对可能影响检测结果的因素进行初步考察，筛选出最佳反应体系和条件，如引物特异性、引物浓度、模板浓度、DNA冻融稳定性、DNA纯度、退火温度等，为基因拷贝数检测方法的验证提供可靠的支撑。
本案例以重组毕赤酵母工程菌株作为待测样本，采用荧光染料法建立了重组毕赤酵母基因拷贝数的检测方法。
分别构建内参基因和目的基因克隆载体，提取标准质粒并采用微量分光光度计测定浓度及纯度，纯度应控制A260/A280值在1.8~2.0之间，根据公式（copies/μL=(6.02×1023) × ( ng/μL×10-9)/(重组质粒长度×660)）计算出标准质粒拷贝数。
采用毕赤酵母基因组DNA提取试剂盒提取重组毕赤酵母基因组DNA，并采用微量分光光度计测定浓度及纯度，纯度应控制A260/A280值在1.8~2.0之间。
标准质粒按梯度稀释至103、104、105、106、107、108copies/μL，进行PCR扩增，得到较好的S型扩增曲线），分别绘制内参基因和目的基因标准曲线），符合可接受标准。
图4 内参基因扩增曲线图（左）和内参基因熔解曲线 内参基因（左）和目的基因标准曲线.方法学验证
采用内标和外标建立双标曲线，根据双标曲线分别计算出待测样本中内参基因起始拷贝数和目的基因起始拷贝数，目的基因拷贝数即为目的基因起始拷贝数与内参基因起始拷贝数的比值。
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