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本发明公开了一种适用于脐血来源免疫细胞扩增的培养液,包括基础培养基和添加组分,其中,所述添加组分的组成及浓度如下,人白蛋白1,20g/L,人转铁蛋白3,20mg/L,人胰岛素5,20mg/L,乙醇胺1,5mg/L,人胆固醇5,50mg/
L,PHA0.1,2mg/L,IGF‑10.5,50mg/L。本发明的适用于脐血来源免疫细胞扩增的培养液,不含血清成分,用于培养脐血来源的免疫细胞时,培养成本低,细胞生长密度高,可规模化培养,培养所得细胞对肿瘤细胞或衰老细胞的杀伤能力强。
2.根据权利要求1所述的适用于脐血来源免疫细胞扩增的培养液,其特征在于,所述基础培养基选自IMDM培养基。
3.根据权利要求1或2所述的适用于脐血来源免疫细胞扩增的培养液,其特征在于,所述添加组分的组成及浓度如下,人白蛋白15g/L,人转铁蛋白14mg/L,人胰岛素7mg/L,乙醇胺2mg/L,人胆固醇10mg/L,过氧化氢酶25mg/L,亚硒酸钠15mg/L,PHA1mg/L,IGF‑120mg/
4.根据权利要求1,3中任一项所述的适用于脐血来源免疫细胞扩增的培养液,其特征在于,还包括扩增因子,所述扩增因子的组分及浓度如下,OKT‑30.1mg/L,IFN‑γ106IU/L,IL‑2106IU/L。
5.权利要求1,4中任一项所述的适用于脐血来源免疫细胞扩增的培养液的制备方法,其特征在于,将各添加组分加入到基础培养基中,混匀,调节PH值在7.0,7.4,即得。
6.权利要求1,4中任一项所述的适用于脐血来源免疫细胞扩增的培养液在脐血来源免疫细胞的培养、增殖、分化中的应用。
[0001]本发明涉及一种适用于脐血来源免疫细胞扩增的培养液,属于免疫细胞培养技术领域。
[0002]细胞治疗是目前医药健康领域最有前景的研究方向之一,其中免疫细胞治疗各项临床研究展现出了乐观有效的临床数据,为肿瘤患者带来新的希望,成为继手术、放疗和化疗之后的“第四种疗法”。目前在ClinicalTrails登记的细胞治疗相关临床研究已将近7800件,其中仅CAR‑T相关的临床研究即已达到320件。在日本、中国台湾、韩国等地,免疫细胞治疗已作为医疗技术得到大量应用。我国相关部门也在不断探索免疫细胞应用的法律法规和应用模式。
[0003]在未来免疫细胞治疗应用前景长期看好的前提下,关于免疫细胞培养液方面的研究寥寥无几,目前仅有几家国际公司有商品化的免疫细胞培养液,如Corning、Lonza、Gibco等,价格相对较高,且更适用于外周血免疫细胞培养。
[0004]随着免疫细胞产品越来越细分化,需要针对不同的目的需求开发适应性更强的培养液。脐血来源的免疫细胞具有取材方便、分化程度低、杀伤活性好、易于规模化培养等天然优点,因此其扩增技术在未来的细胞治疗领域有着更加广阔的应用前景。但由于脐血来源的免疫细胞扩增难度相对较大,目前市面上并无针对脐血来源免疫细胞特点的扩增试剂,无法实现脐血来源免疫细胞大规模、高密度的培养。
[0005]在传统细胞培养中,为了促进生长,培养液中通常会添加动物源性血清等生物活性成分,这一点在临床应用上是不被法规允许的,因为外源性生物活性成分可能会带来批间差异和外源基因污染等风险。
[0006]针对上述现有技术,本发明提供了一种适用于脐血来源免疫细胞扩增的培养液,本发明的培养液能够实现脐血来源免疫细胞的规模化扩增,培养成本低,细胞生长密度高,可规模化培养,培养所得细胞对肿瘤细胞或衰老细胞的杀伤能力强。
[0008]一种适用于脐血来源免疫细胞扩增的培养液,命名为YFH01,包括基础培养基和添加组分,其中,所述添加组分的组成及浓度如下,人白蛋白1,20g/L,人转铁蛋白3,20mg/
[0011]进一步地,还包括扩增因子,所述扩增因子的组分及浓度如下,OKT‑30.1mg/L,IFN‑γ106IU/L,IL‑2106IU/L。所述扩增因子可在培养初期或培养过程中添加。
[0012]所述适用于脐血来源免疫细胞扩增的培养液的制备方法,将各添加组分加入到基础培养基中,混匀,调节PH值在7.0,7.4,即得。
[0013]所述适用于脐血来源免疫细胞扩增的培养液在脐血来源免疫细胞的培养、增殖、分化中的应用。
[0014]本发明的适用于脐血来源免疫细胞扩增的培养液,经研究试验发现,培养脐血来源的免疫细胞采时,能够使得免疫细胞高密度、规模化增殖,并且培养获得的细胞对肿瘤细胞有很好的杀伤能力。所述添加组分中,PHA(植物血凝素)通常用来提高巨噬细胞的吞噬作用和促进骨髓造血功能,IGF‑1是一种降血糖降血脂的药物,现有技术中并不用于培养免疫细胞,而本发明通过实验意外地发现,添加PHA和IGF‑1后,取得了极好的促增殖效果。
[0015] 本发明的适用于脐血来源免疫细胞扩增的培养液,不含血清成分,不用担心安全问题。也无需担心营养问题(在脐血来源的免疫细胞培养中,样本自身存在的血清即可满足培养所需营养需求) 。用于培养脐血来源的免疫细胞时,培养成本低,细胞生长密度高,可规模化培养,培养所得细胞对肿瘤细胞或衰老细胞的杀伤能力强,优于RPMI1640培养液和KBM581培养液。
[0016] 本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
[0017] 图1 ,三中培养液培养脐血来源免疫细胞的生长曲线示意图(细胞总数随天数的变化) 。
[0022] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而,本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解,在不背离本发明的精神和范围的前提下,可以对本发明进行各种变化和修饰。
[0023] 下述实施例中星空体育 星空体育平台所涉及的仪器、试剂、材料等,若无特别说明,均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等,可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法,检测方法等,若无特别说明,均为现有技术中已有的常规实验方法,检测方法等。
[0027] 取CPDA‑1抗凝脐血一份50mL,转入50mL离心管中,800g离心10min,将上层血浆转移到另一无菌离心管中,56℃水浴30min灭活,再次800g离心10min,收集上清血浆分装保存备用。
[0028] 将第一次离心后的下层血细胞沉淀用血浆等体积的生理盐水重悬后转移到预加淋巴细胞分离液的离心管中,400g离心20分钟,升速刹车中速,降速刹车0。离心结束后,小心吸取第二层即白膜层至新离心管中,补加生理盐水清洗2次。弃上清,细胞沉淀用3mL自体血浆重悬,吹打混匀后取200μL计数测活性。
L。三份细胞均置于37℃、5,CO2饱和湿度培养箱中培养,每48小时取样,用血细胞分析仪计数、台盼蓝染色法检测活性,培养至14天时收集扩增后的免疫细胞待用。
[0031] 将每次取样计数结果和对应的体积相乘,计算得到各时间点的细胞总数,将三组实验的细胞总数以时间为横轴做出生殖曲线) ,从该曲线无血清培养液所培养的细胞增殖最快,KBM581次之,二者的最终扩增倍数都在130倍以上,且最终细胞密度比较高,RPMI1640增殖相对较慢,维持的细胞密度也比较低,且最终扩增倍数也偏低。三组细胞的活率都≥98,。
[0034] 结果如图2、图3所示,杀伤24h时YFH01组的细胞能达到大于60,的杀伤活性,KBM581组的细胞杀伤活性略低,但也能达到55,,而RPMI1640组的细胞杀伤活性仅能达到
[0036] 在实施例1配制的YFH01无血清培养液的基础上,调整PHA的浓度分别为,0mg/L、
1 .0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L,用于培养脐血来源的免疫细胞(按实施例3的培养方法培养14天计算增殖倍数) ,比较不同浓度下对增殖倍数的影响,结果如图4A所示。由图4A
可见,是否添加PHA对增殖倍数有本质影响,添加1 .0,2.0mg/L的PHA可显著提高增殖倍数。
[0037] 在实施例1配制的YFH01无血清培养液的基础上,调整PHA的浓度分别为,0mg/L、
0. 1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L,用于培养脐血来源的免疫细胞(按实施例3的培养方法培养14天计算增殖倍数) ,比较不同浓度下对增殖倍数的影响,结果如图4B所示。由图4B 可见,添加浓度0. 1,0.4mg/L的PHA可显著提高增殖倍数。
[0040] 在实施例1配制的YFH01无血清培养液的基础上,调整IGF‑1的浓度分别为,0mg/L、
0.5mg/L、5mg/L、50mg/L、500mg/L,用于培养脐血来源的免疫细胞(按实施例3的培养方法培养14天计算增殖倍数) ,计算增殖倍数,比较不同浓度下对增殖倍数的影响,结果如图5A所示。由图5A可见,是否添加IGF‑1对增殖倍数有本质影响,添加0.5,50mg/L的IGF‑1可显著提高增殖倍数。
[0041] 在实施例1配制的YFH01无血清培养液的基础上,调整IGF‑1的浓度分别为,0mg/L、
[0051] 给本领域技术人员提供上述实施例,以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案,而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。