NK 细胞疗法是一种很有前景的抗癌策略，但 NK 细胞疗法的广泛临床成功在一定程度上受到制造大剂量 NK 细胞的挑战的限制，这可能是临床疗效所必需的[12]。NK 细胞仅占外周血淋巴细胞的 10-15%。而临床试验表明，高剂量 NK 细胞 (109/kg) 既安全又可能是疗效所必需的 [13,14,15,16]。制造大量 NK 细胞的另一个主要优势是它们作为通用供体“现成”疗法的潜在用途。这种扩增方法支持使用来自单个供体扩增的 NK 细胞来治疗多个患者。
之前已经报道过几个NK的扩增平台，但是很少有临床级扩增平台可以支持高细胞毒性 NK 细胞的大规模扩增。例如，NK 细胞已用 IL-2 以及各种其他细胞因子组合如 IL-12、IL-15、IL-18 和 IL-21 进行扩增。这些基于细胞因子的扩增方法导致具有类似记忆特征的高细胞毒性 NK 细胞，但据报道，由于 NK 细胞衰老，倍数扩增有限（扩增第 10 天时约为 4 倍）[17,18,19]。使用经辐照的辅助细胞作为抗原呈递“饲养”细胞的扩增方法可提高产量[20,21,22]。例如，用辐照的 PBMC 和 OKT3 扩增 NK 细胞可以在 17 天将 NK 细胞扩增 2300 倍[23]。另一个系统涉及 Epstein-Barr 病毒转化的淋巴母细胞饲养细胞，这导致 NK 细胞衰老前 2-4 周的强劲扩增[24]。为了解决衰老问题，K562 饲养细胞被设计为表达具有 4-1BB 配体的膜结合 IL-21 (mbIL-21)，从而允许更长时间的 NK 细胞培养[21,22,25,26,27]。
为 ACT 扩增 NK 细胞的其他方法包括使用永生化 NK 细胞系，例如 NK-92 细胞。这种方法的一个主要挑战是必须在患者给药前对细胞进行辐照，这限制了这种治疗策略的功效，因为细胞不能在患者体内扩增并维持抗肿瘤活性[28,29]。
本文我们报告了一种基于mbIL-21 的新型 NK 细胞饲养细胞系的创建，该细胞系可以支持大剂量的高度活化 NK 细胞的生成。我们最近利用该平台为最近启动的 1 期临床试验制造“通用供体”NK 细胞。此外，我们通过激活 IL-21 依赖性信号传导导致代谢变化使细胞增殖和杀死癌细胞来表征 mbIL-21 驱动 NK 细胞生长和活化的机制。
据报道，膜结合 IL-21 (mbIL-21) 的存在可以防止NK 细胞衰老，显着提高它们的体外扩增能力[25]。使用转导mbIL-21 (NKF) 的 OCI-AML3 细胞开发了一种新型 NK 饲养细胞（补充图 1C）。
为了扩大外周血分离的 NK 细胞，从 PBMC 中分离出NK 细胞（总 PBMC 的 9%（CI 95%：6.178-15.14），并与每周添加的辐照 NKF 细胞共培养（图 1A）。通过流式细胞术评估了 15 个供体的扩增 NK 细胞的纯度。扩增 2 周后，CD56+/CD3− 细胞约占扩增细胞的 94%（CI 95%：92.32–96.53），CD3+ 细胞占 1%（CI95%：0.069–1.03），B 细胞为几乎无法检测到（图 1B、C）。大约 87% 的扩增 NK 细胞是 CD56+/CD16+，表明这些细胞中的很大一部分可以介导 ADCC。扩增后的低 T 细胞污染对于避免通用供体 NK 细胞的潜在移植物抗宿主病很重要。
NKF 扩展平台基于 NKF 与 NK 的比率和 IL-2 浓度进行了优化。添加饲养细胞的目标是在限制饲养细胞数量的同时产生稳健的扩增，以避免最终产品中不必要地存在多余的死饲养细胞。3 周后，以 5-1（NKF 与 NK）比例扩增导致 NK 细胞产量比1-1 比例高 8.3 倍（p = 0.017），NK 细胞产量比 1-1 倍高 到2-1 的比率（p = 0.057）（图 1D）。IL-2 浓度范围为 10-1000 U/mL 时的扩增产率没有导致统计学上的显着差异（图 1E）。这与之前的报告一致，即高 IL-2 浓度不影响 NK 细胞饲养细胞扩增的增殖能力 31,32,33,34。200 U/mL IL-2 的产量最高，因此随后的扩增以 5-1 的饲养细胞与 NK 细胞的比例和 200 U/mL IL-2 进行。
与用于过继细胞疗法的传统 NK 细胞来源 IL-2 过夜活化 NK (IL-2-NK) 细胞相比，评估了 2 周扩增的 NKF 扩增 NK 细胞 (NKF-NK) 的细胞毒活性使用基于流式细胞术的细胞毒性测定。具体如下：
通过测量钙黄绿素-AM (CAM) 标记鉴定的活细胞数量来评估 NK 细胞的细胞毒功能。靶细胞和 NK 细胞分别用 CAM (BD Pharmingen) 和钙黄绿素 (CV)(eBioscience) 标记。NK 细胞与靶细胞以指定比例共培养 4 小时，一式三份，通过流式细胞术（Attune NXT，Invitrogen）在 96 孔板中分析样品。门控 CV 阳性 NK 细胞进行分析。细胞裂解百分比计算如下：
与 IL-2-NK 细胞相比，NKF-NK 细胞对多种癌细胞系表现出显着增加的细胞毒活性（图 2A、B 和补充图 3）。NKF-NK 细胞对 Jurkat 和 TC106 细胞的杀伤率分别比 IL-2-NK 细胞高 31% (p = 0.003) 和 37% (p = 0.009)，NK 靶标比例为 1-1。为了进一步评估 NKF-NK 细胞毒活性，将这些细胞与白血病、淋巴瘤和结肠癌细胞系以各种 NK 靶细胞比例共培养。NKF-NK 细胞表现出对所有测试细胞类型的剂量依赖性杀伤（图 2C）。我们进一步比较了 NKF 扩增的 NK 细胞与 mbIL21-K562 扩增的 NK 细胞的细胞毒活性。
使用流式细胞术，在 IL-2-NK 和 2 周扩增的 NKF-NK 中测量了关键 NK 细胞表面分子的基线表达水平。为了进行直接比较，对两个 NK 细胞群使用相同的供体（n=4）。与 IL-2NK 细胞相比，NKF 细胞的扩增导致活化受体 NKG2D、NKp30 和 NKp44 的表达增加（图 3A 和补充图 4）。激活受体如NKG2D 和天然细胞毒性受体对 NK 细胞激活和功能至关重要[35]。
NKF-NK 细胞的杀伤性免疫球蛋白受体 (KIR) 的表达也显着降低（图 3B）。NKF 细胞的扩增还导致粘附受体（LFA-1 和 CD54）的增加，这对于NK 细胞与肿瘤靶标的结合很重要，增强细胞溶解（图 3C 和补充图 4）CD57 表达，表示 NK 的终末分化细胞，也被测量并发现在 NKF-NK 细胞中减少（图 3D）。
表达高水平 CD57 的 NK 细胞在体内的持续增殖能力受到限制。最后，分析了调节 NK 细胞体内运输的关键趋化因子受体的表达。NKF 扩增导致 CXCR4 减少，CXCR4 是一种受体，据报道可以隔离骨髓中的 NK 细胞（图 3E）。此外，CXCR6的增加表明 NKF-NK 细胞可以转移到肝脏，这是癌症转移的常见部位。在半抗原或病毒暴露后持续存在的记忆样 NK 细胞的发育中也表明 CXCR6。
虽然与 NKF 细胞的短期共培养会导致 NK 细胞增殖和激活，但为了支持“通用供体”NK 细胞临床研究，持续增殖是必要的。与迅速衰老的 IL-2 处理的 NK 细胞不同，NKF 细胞能够实现长期的 NK 细胞增殖。例如，扩张 5 周后，平均扩张 10,973 倍（补充图 3A）。
为了支持 NKF 扩增 NK 细胞的临床转化，还需要利用高容量培养装置来适应高细胞数量。我们测试了新鲜分离的 NK 细胞在 G-REX 装置中扩增的能力。NK 细胞用 NKF 细胞扩增 2 周，平均 NK 细胞产量为 89 倍（补充图3B）。这表明半自动化 G-REX 系统能够利用 NKF 饲养细胞扩增 NK 细胞。
由于免疫细胞的活性和增殖状态在很大程度上取决于它们的代谢能力，因此研究星空体育登录入口 星空体育在线官网了 mbIL-21 信号传导对 NK 细胞代谢的影响。激活后，免疫细胞的代谢通常从主要通过氧化磷酸化产生能量转变为有氧糖酵解。在 NKF-NK、OCI-NK 和IL-2-NK 细胞中测量了测量氧化磷酸化 (oxphos) 速率的耗氧率 (OCR) 和测量糖酵解的细胞外酸化率 (ECAR)（图 4C）。在基线时，NKF-NK 细胞和OCI-NK 细胞具有相同的 oxphos 和糖酵解率（图4D、E）。在压力下，与 OCI-NK 细胞相比，NKF-NK 细胞具有更高的 OCR（p= 0.043）和 ECAR（p = 0.0015）值（图 4D，E）。两种扩增的 NK 细胞群都具有比 IL-2-NK 更高的 OCR 和ECAR 值（图 4D、E）。NKF-NK 细胞的 OCR/ECAR 比率接近 1，表明糖酵解和 oxphos 途径的平衡（图 4F）。NKF-NK 的能量状态高于OCI-NK 和 IL-2-NK 的能量状态，如在 OCR 与 ECAR 图中观察到的（图 4G）。
由于 mbIL-21 在饲养细胞扩增过程中导致 NK 细胞增殖和代谢增强，我们还评估了其对 NK 细胞细胞毒活性的影响。虽然与非饲养层扩增细胞相比，NKF-NK 细胞表现出细胞毒活性的显着增加（图 2A、B），但 NKF-NK 和 OCI-NK细胞的细胞毒功能没有显着差异（图 4H） .该结果表明，至少在饲养细胞存在的情况下，mbIL-21 可能不会显着影响 NK 细胞的细胞毒性。
通过向NSG小鼠IV注射1 × 106 Jurkat细胞建立白血病异种移植模型。注射后7天，小鼠（每组n = 5）每周接受5× 106个NK细胞或载体以及IL-2（75,000 U/ml）。根据机构指导方针，在垂死或失去其初始体重的 15% 后处死小鼠。收获小鼠的组织进行免疫染色。
为了评估 NKF-NK 细胞对癌症治疗的治疗潜力，使用了肉瘤和淋巴样白血病的小鼠模型。对于肉瘤模型，将尤文氏肉瘤细胞系 TC106 皮下注射到免疫缺陷 NSG 小鼠中。采用肉瘤模型是因为它会导致肺部转移，这是人类肉瘤最常见的转移部位，也是体内 NK 细胞运输的已知部位[45,46]。在该模型中，我们不仅观察到 NKF-NK 细胞给药后原发性肉瘤的生长减少，而且肿瘤向肺的转移也显着减少（图5A-C）。来自载体处理的小鼠和 NKF-NK 处理的小鼠的肺标本的 Ki67 染色显示，与载体处理的小鼠相比，NKF-NK 处理的小鼠中肿瘤细胞的增殖降低（p = 0.023）（图 5D，E）。
除了评估 NKF 扩增的 NK 细胞减少肿瘤生长的能力外，还评估了这些细胞在高度侵袭性循环淋巴细胞白血病模型中延长存活的能力。NSG 小鼠静脉注射 Jurkat 细胞以建立循环疾病。与对照处理的小鼠相比，注射 NKF-NK 细胞的小鼠的存活率中位数增加了大约 13 天（p = 0.0016）（图 5F）。
过继 NK 细胞疗法在癌症治疗领域显示出前景，但开发其他稳健方法来扩增大量高度活化的 NK 细胞对于继续推进该领域很重要。此外，进一步了解实现这种扩展的机制对于制定最佳策略很重要。在这里，我们报告了一种新型饲养系 NKF 的开发，它可以支持“通用供体”NK细胞治疗临床试验，并阐明 mbIL-21 如何影响 NK 细胞扩增和激活。由于可用于临床的强大的体外扩增平台的可用性有限，因此开发新的馈线 饲养细胞相比，NKF 细胞在 NK 细胞扩增和对癌细胞的细胞毒性方面表现相似。由于 K562-mbIL21 饲养细胞不再可用于广泛的临床应用，NKF 平台可能会提供一个有价值的替代方案。
由于 NK 细胞与 T 细胞不同，被认为不会引起移植物抗宿主病，因此开发“通用供体”现成 NK 细胞有许多好处。从逻辑上讲，该策略将显着降低成本并增加该治疗策略在全球范围内的可及性。尽管体外扩增的方法很有前景，但每位预期患者的捐赠者需求以及每位患者的细胞处理所产生的相关成本（物流和财务）仍然限制了过继 NK 细胞疗法的可行性。强大的扩增系统，如 NKF 饲养细胞，应该能够为 100 名或更多受者从单个供体生产 NK 细胞剂量。能够从一个供体中收获 NK 细胞将大大降低这种治疗方法的成本。利用与 HLA 不匹配的供体与受体也增加了 NK 细胞同种异体反应的潜力，以促进“移植物抗白血病 (GVL)”效应（无 GVHD）。已发现这可以提高某些癌症患者群体的无病生存率 47,48,49。
为了改进当前的 NK 细胞疗法，临床前研究表明 NK 细胞与免疫调节剂（如 TGFβ 抑制剂）的组合提供了希望。例如，扩增的 NK 细胞与 Galunisertib 的组合导致结肠癌转移小鼠模型的抗肿瘤功效显着增加[51]。此外，免疫调节剂来那度胺可增强 NK 细胞对多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性[52]。
利用未扩增的 NK 细胞和用NKF 扩增的 NK 细胞或缺乏 mbIL-21 的亲本饲养细胞，我们进一步评估了 mbIL-21 维持 NK 细胞扩增的机制。我们的研究表明，mbIL-21 会激活由 STAT3 和cMyc 组成的已充分表征的 IL-21 依赖性通路。STAT3 激活对于 IL-21 信号传导的下游效应是必要的，并且是 c-Myc 的已知诱导剂。已知 cMyc 的激活可调节各种细胞过程，这对 NK 细胞增殖和活动很重要，包括诱导糖酵解、线粒体生物发生和细胞周期[53-55]。有趣的是，缺乏mbIL-21 的亲代 OCI-AML3 饲养细胞的 NK 扩增导致 STAT3/cMyc 通路的部分激活，这可能是因为许多其他受体信号通路的激活也可以导致最小的 STAT3 激活。
总的来说，NK 过继细胞疗法是一种很有前景的治疗方法，它依赖于强大的体外扩增平台的开发，例如可以支持高活性临床级 NK 细胞制造的 NKF 细胞。