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2、54)发明名称 一种免疫细胞体外诱导扩增方法 (57)摘要 本发明公开了细胞培养相关技术领域的一 种免疫细胞体外诱导扩增方法， 包括制备包被后 的培养容器； 将经过分离制得的免疫细胞的单个 核细胞置于包被后的培养容器中， 进行免疫细胞 激活培养2436h， 制得激活的免疫细胞； 制备诱 导扩增的免疫细胞； 分化培养制备分化的免疫细 胞； 制备规模化扩增的免疫细胞， 并在控制细胞 密度为0.81.2106个/mL的条件下每23d天 传代一次； 免疫细胞体外诱导扩增培养体系清晰 明了、 扩增倍数高； 利用本发明免疫细胞体外诱 导扩增方法制备的免疫细胞免疫的效果好， 有效 降低安全风险。 权利要求书。
3、1页 说明书6页 附图1页 CN 111019892 A 2020.04.17 CN 111019892 A 1.一种免疫细胞体外诱导扩增方法， 其特征在于： 包括以下步骤： S1)用CD16抗体包被培养容器， 制得包被后的培养容器； S2)用含有-干扰素的免疫细胞激活培养基， 将经过分离制得的免疫细胞的单个核细 胞置于所述包被后的培养容器中， 进行免疫细胞激活培养2436h， 制得激活的免疫细胞； S3)用免疫细胞扩增培养基对所述激活的免疫细胞进行诱导扩增培养， 制得诱导扩增 的免疫细胞； S4)当所述诱导扩增的免疫细胞的CD56抗体的表达超过70时， 进行分化培养， 制得分 化的免疫细胞；。
4、 S5)当所述分化的免疫细胞的CD56抗体的表达超过90时， 利用免疫细胞规模化扩增 培养基对所述分化的免疫细胞进行规模化扩增培养， 制得规模化扩增的免疫细胞， 并在控 制细胞密度为0.81.2106个/mL的条件下每23d天传代一次。 2.根据权利要求1所述的免疫细胞体外诱导扩增方法， 其特征在于： 所述免疫细胞为自 然杀伤细胞或树突状细胞。 3.根据权利要求1所述的免疫细胞体外诱导扩增方法， 其特征在于： 所述免疫细胞激活 培养基为基础培养基中包含有以下浓度的组分： 812体积百分比的自体血浆、 500800U/ mL-干扰素、 8001200U/mL白介素-2和0.0080.012KE/。
5、mL沙培林。 4.根据权利要求1所述的免疫细胞体外诱导扩增方法， 其特征在于： 所述免疫细胞扩增 培养基为基础培养基中包含有以下浓度的组分： 200300U/mL白细胞介素-1、 300500U/ mL白细胞介素-2和0.0080.012KE/mL沙培林。 5.根据权利要求1所述的免疫细胞体外诱导扩增方法， 其特征在于： 所述免疫细胞规模 化扩增培养基为基础培养基中包含有以下浓度的组分： 200300U/mL白细胞介素-1、 300 500U/mL白细胞介素-2。 6.根据权利要求35任一项所述的免疫细胞体外诱导扩增方法， 其特征在于： 所述基 础培养基为OpTmizer TMCTSTM无血清。
6、培养基或SuperCulture TmL500人淋巴细胞无血清培 养基。 7.根据权利要求15任一项所述的免疫细胞体外诱导扩增方法， 其特征在于： S5)操作 后还包括S6)将所述规模化扩增的免疫细胞冷冻保存， 以及S7)将冷冻保存的所述规模化扩 增的免疫细胞解冻复苏。 8.根据权利要求7所述的免疫细胞体外诱导扩增方法， 其特征在于： 所述冷冻保存的具 体操作为将所述规模化扩增的免疫细胞按照107109个/mL的数量悬浮于免疫细胞冻存液 中冻存； 所述免疫细胞冻存液包括按体积百分比计的以下组分： 38的DMSO、 315的 HSA、 3060的自体血浆， 还包括0.0010.003g/mL的白。
7、酒草皂苷R； 余量为1640培养基或 Stemspan培养基。 9.根据权利要求8所述的免疫细胞体外诱导扩增方法， 其特征在于： 所述解冻复苏的具 体操作为向所述免疫细胞冻存液中加入所述免疫细胞冻存液重量35倍冷冻复苏液， 然后 置于3742水浴中融化。 10.根据权利要求9所述的免疫细胞体外诱导扩增方法， 其特征在于： 所述冷冻复苏液 包含按重量百分比计的以下组分13人白蛋白、 26右旋糖酐40、 1015胎牛血清， 余量为1640培养基或Stemspan培养基。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111019892 A 2 一种免疫细胞体外诱导扩增方法 技术领域 0001 本发明涉及细胞培。
8、养相关技术领域， 特别涉及一种免疫细胞体外诱导扩增方法。 背景技术 0002 生物免疫细胞治疗是通过体外培养、 增殖、 激活， 回输体内诱导自体抗病毒免疫应 答， 从而使得人体抗病毒免疫被激活后源源不断地产生抗病毒的物质杀灭病毒。 免疫细胞 对肿瘤细胞、 细菌等的识别能力很强， 如同 “细胞导弹” ， 能精确 “点射” 肿瘤细胞或细菌， 但 不会伤及 “无辜” 的正常细胞， 是一种十分有效的治疗方式。 0003 但是， 现有技术中， 对于免疫细胞体外诱导扩增培养体系繁杂、 扩增倍数不高、 免 疫效果不佳， 存在安全上的风险。 发明内容 0004 针对现有技术存在的对于免疫细胞体外诱导扩增培养体。
9、系繁杂、 扩增倍数不高、 免疫效果不佳， 存在安全上的风险的技术问题， 本发明提供一种免疫细胞体外诱导扩增方 法。 0005 为实现上述目的， 本发明的技术方案为： 0006 一种免疫细胞体外诱导扩增方法， 包括以下步骤： 0007 S1)用CD16抗体包被培养容器， 制得包被后的培养容器； 0008 S2)用含有-干扰素的免疫细胞激活培养基， 将经过分离制得的免疫星空体育登录入口 星空体育在线官网细胞的单个 核细胞置于所述包被后的培养容器中， 进行免疫细胞激活培养2436h， 制得激活的免疫细 胞； 0009 S3)用免疫细胞扩增培养基对所述激活的免疫细胞进行诱导扩增培养， 制得诱导 扩增的免疫细胞； 0010 S4)当所述。
10、诱导扩增的免疫细胞的CD56抗体的表达超过70时， 进行分化培养， 制 得分化的免疫细胞； 0011 S5)当所述分化的免疫细胞的CD56抗体的表达超过90时， 利用免疫细胞规模化 扩增培养基对所述分化的免疫细胞进行规模化扩增培养， 制得规模化扩增的免疫细胞， 并 在控制细胞密度为0.81.2106个/mL的条件下每23d天传代一次。 0012 进一步的， 所述免疫细胞为自然杀伤细胞或树突状细胞。 0013 进一步的， 所述免疫细胞激活培养基为基础培养基中包含有以下浓度的组分： 8 12体积百分比的自体血浆、 500800U/mL-干扰素、 8001200U/mL白介素-2和0.008 0.0。
12、perCultureTmL500人淋巴细胞无血清培养基。 0017 进一步的， 在上述任一项所述的免疫细胞体外诱导扩增方法中， S5)操作后还包括 S6)将所述规模化扩增的免疫细胞冷冻保存， 以及S7)将冷冻保存的所述规模化扩增的免疫 细胞解冻复苏。 0018 进一步的， 所述冷冻保存的具体操作为将所述规模化扩增的免疫细胞按照107 109个/mL的数量悬浮于免疫细胞冻存液中冻存； 所述免疫细胞冻存液包括按体积百分比计 的以下组分： 38的DMSO、 315的HSA、 3060的自体血浆， 还包括0.0010.003g/ mL的白酒草皂苷R； 余量为1640培养基或Stemspan培养基。 0。
13、019 进一步的， 所述解冻复苏的具体操作为向所述免疫细胞冻存液中加入所述免疫细 胞冻存液重量35倍冷冻复苏液， 然后置于3742水浴中融化。 0020 进一步的， 所述冷冻复苏液包含按重量百分比计的以下组分13人白蛋白、 2 6右旋糖酐40、 1015胎牛血清， 余量为1640培养基或Stemspan培养基。 0021 本发明具有如下优点： 0022 1.免疫细胞体外诱导扩增培养体系清晰明了、 扩增倍数高； 0023 2.利用本发明免疫细胞体外诱导扩增方法制备的免疫细胞免疫的效果好， 有效降 低安全风险。 附图说明 0024 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实施。
14、例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以 根据这些附图获得其他的附图。 0025 图1为本发明的制备流程示意图。 具体实施方式 0026 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。 在此需要说明的是， 对于 这些实施方式的说明用于帮助理解本发明， 但并不构成对本发明的限定。 此外， 下面所描述 的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。 0027 如图1的制备流程示意图所示， 本发明的免疫细胞体外诱导扩增方法的具体实施。
15、 例如下： 0028 实施例A13:免疫细胞激活培养基的配置 0029 实施例A1： 0030 以OpTmizer TMCTSTM无血清培养基为基础培养基， 向其中加入相关组分， 并使基 础培养基中含有的组分及其最终浓度为： 8体积百分比的自体血浆、 500U/mL-干扰素、 800U/mL白介素-2和0.008KE/mL沙培林。 0031 实施例A2： 0032 以SuperCulture TmL500人淋巴细胞无血清培养基为基础培养基， 向其中加入相 关组分， 并使基础培养基中含有的组分及其最终浓度为： 10体积百分比的自体血浆、 600U/ 说明书 2/6 页 4 CN 11101989。
16、2 A 4 mL-干扰素、 1000U/mL白介素-2和0.01KE/mL沙培林。 0033 实施例A3： 0034 以SuperCulture TmL500人淋巴细胞无血清培养基为基础培养基， 向其中加入相 关组分， 并使基础培养基中含有的组分及其最终浓度为： 12体积百分比的自体血浆、 800U/ mL-干扰素、 1200U/mL白介素-2和0.012KE/mL沙培林。 0035 实施例B13:免疫细胞扩增培养基的配置 0036 实施例B1： 0037 以OpTmizer TMCTSTM无血清培养基为基础培养基， 向其中加入相关组分， 并使基 础培养基中含有的组分及其最终浓度为： 200U。
18、/mL沙培林。 0042 实施例C13:免疫细胞规模化扩增培养基的配置 0043 实施例C1： 0044 以OpTmizer TMCTSTM无血清培养基为基础培养基， 向其中加入相关组分， 并使基 础培养基中含有的组分及其最终浓度为： 免疫细胞规模化扩增培养基为基础培养基中包含 有以下浓度的组分： 200U/mL白细胞介素-1、 300U/mL白细胞介素-2。 0045 实施例C2： 0046 以SuperCulture TmL500人淋巴细胞无血清培养基为基础培养基， 向其中加入相 关组分， 并使基础培养基中含有的组分及其最终浓度为： 免疫细胞规模化扩增培养基为基 础培养基中包含有以下浓度的。
19、组分： 250U/mL白细胞介素-1、 400U/mL白细胞介素-2。 0047 实施例C3： 0048 以OpTmizer TMCTSTM无血清培养基为基础培养基， 向其中加入相关组分， 并使基 础培养基中含有的组分及其最终浓度为： 免疫细胞规模化扩增培养基为基础培养基中包含 有以下浓度的组分： 300U/mL白细胞介素-1、 500U/mL白细胞介素-2。 0049 实施例D13:免疫细胞冻存液的配置 0050 实施例D1： 0051 以1640培养基为基础培养基， 并向其中加入相关组分， 并使这些组分占最终总培 养基体积的百分比或浓度为： 3的DMSO、 3的HSA、 30的自体血浆、 。
20、0.001g/mL的白酒草 皂苷R。 0052 实施例D2： 0053 以Stemspan培养基为基础培养基， 并向其中加入相关组分， 并使这些组分占最终 总培养基体积的百分比或浓度为： 5的DMSO、 9的HSA、 40的自体血浆、 0.002g/mL的白 说明书 3/6 页 5 CN 111019892 A 5 酒草皂苷R。 0054 实施例D3： 0055 以Stemspan培养基为基础培养基， 并向其中加入相关组分， 并使这些组分占最终 总培养基体积的百分比或浓度为： 8的DMSO、 15的HSA、 60的自体血浆、 0.003g/mL的白 酒草皂苷R。 0056 实施例E13:冷冻复。
21、苏液的配置 0057 实施例E1： 0058 以1640培养基为基础培养基， 并向其中加入相关组分， 并使这些组分占最终总培 养基体积的百分比为： 1人白蛋白、 2右旋糖酐40、 10胎牛血清。 0059 实施例E2： 0060 以1640培养基为基础培养基， 并向其中加入相关组分， 并使这些组分占最终总培 养基体积的百分比为： 2人白蛋白、 4右旋糖酐40、 13胎牛血清。 0061 实施例E3： 0062 以Stemspan培养基为基础培养基， 并向其中加入相关组分， 并使这些组分占最终 总培养基体积的百分比为： 3人白蛋白、 6右旋糖酐40、 15胎牛血清。 0063 实施例X16:免疫。
22、细胞体外诱导扩增方法 0064 实施例X1： 0065 S1)用CD16抗体包被培养容器， 制得包被后的培养容器； 0066 S2)用实施例A1配置的含有-干扰素的免疫细胞激活培养基， 将经过分离制得的 自然杀伤细胞的单个核细胞置于包被后的培养容器中， 进行免疫细胞激活培养24h， 制得激 活的免疫细胞； 0067 S3)用实施例B1配置的免疫细胞扩增培养基对激活的免疫细胞进行诱导扩增培 养， 制得诱导扩增的免疫细胞； 0068 S4)当诱导扩增的免疫细胞的CD56抗体的表达超过70时， 进行分化培养， 制得分 化的免疫细胞； 0069 S5)当分化的免疫细胞的CD56抗体的表达超过90时， 。
23、利用实施例C1配置的免疫 细胞规模化扩增培养基对分化的免疫细胞进行规模化扩增培养， 制得规模化扩增的免疫细 胞， 并在控制细胞密度为0.8106个/mL的条件下每2d天传代一次。 0070 实施例X2： 0071 S1)用CD16抗体包被培养容器， 制得包被后的培养容器； 0072 S2)用实施例A2配置的含有-干扰素的免疫细胞激活培养基， 将经过分离制得的 树突状细胞的单个核细胞置于包被后的培养容器中， 进行免疫细胞激活培养30h， 制得激活 的免疫细胞； 0073 S3)用实施例B2配置的免疫细胞扩增培养基对激活的免疫细胞进行诱导扩增培 养， 制得诱导扩增的免疫细胞； 0074 S4)当诱。
24、导扩增的免疫细胞的CD56抗体的表达超过75时， 进行分化培养， 制得分 化的免疫细胞； 0075 S5)当分化的免疫细胞的CD56抗体的表达超过92时， 利用实施例C2配置的免疫 细胞规模化扩增培养基对分化的免疫细胞进行规模化扩增培养， 制得规模化扩增的免疫细 说明书 4/6 页 6 CN 111019892 A 6 胞， 并在控制细胞密度为1106个/mL的条件下每2.5d天传代一次。 0076 实施例X3： 0077 S1)用CD16抗体包被培养容器， 制得包被后的培养容器； 0078 S2)用实施例A3配置的含有-干扰素的免疫细胞激活培养基， 将经过分离制得的 自然杀伤细胞的单个核细胞。
25、置于包被后的培养容器中， 进行免疫细胞激活培养36h， 制得激 活的免疫细胞； 0079 S3)用实施例B3配置的免疫细胞扩增培养基对激活的免疫细胞进行诱导扩增培 养， 制得诱导扩增的免疫细胞； 0080 S4)当诱导扩增的免疫细胞的CD56抗体的表达超过80时， 进行分化培养， 制得分 化的免疫细胞； 0081 S5)当分化的免疫细胞的CD56抗体的表达超过95时， 利用实施例C3配置的免疫 细胞规模化扩增培养基对分化的免疫细胞进行规模化扩增培养， 制得规模化扩增的免疫细 胞， 并在控制细胞密度为1.2106个/mL的条件下每3d天传代一次。 0082 实施例X4： 0083 在实施例X1的。
26、基础上， 在S5)操作后还包括以下操作： 0084 S6)将规模化扩增的免疫细胞按照107个/mL的数量悬浮于实施例D1配置的免疫细 胞冻存液中冻存； 0085 S7)向免疫细胞冻存液中加入免疫细胞冻存液重量3倍实施例E1制备的冷冻复苏 液， 然后置于37水浴中融化。 0086 实施例X5： 0087 在实施例X2的基础上， 在S5)操作后还包括以下操作： 0088 S6)将规模化扩增的免疫细胞按照108个/mL的数量悬浮于实施例D2配置的免疫细 胞冻存液中冻存； 0089 S7)向免疫细胞冻存液中加入免疫细胞冻存液重量4倍实施例E2制备的冷冻复苏 液， 然后置于39水浴中融化。 0090 实。
27、施例X6： 0091 在实施例X3的基础上， 在S5)操作后还包括以下操作： 0092 S6)将规模化扩增的免疫细胞按照109个/mL的数量悬浮于实施例D3配置的免疫细 胞冻存液中冻存； 0093 S7)向免疫细胞冻存液中加入免疫细胞冻存液重量5倍实施例E3制备的冷冻复苏 液， 然后置于42水浴中融化。 0094 其中， 实施例X46的免疫细胞体外诱导扩增方法中， 免疫细胞冻存液中冻存具体 过程为： 0095 02min， 免疫细胞冻存液的温度从4下降到-1； 0096 23min， 免疫细胞冻存液的温度从-1上升到0； 0097 36min， 免疫细胞冻存液的温度保持0； 0098 611m。
29、培养后， 细胞扩增的最终结果分别为： 实施例X1中： 0.951010个细胞； 实施例X2中： 1.021010个细胞； 实施例X3中： 1.061010个 细胞。 0106 扩增后的免疫细胞中委托检测平台检测乙肝表面抗原、 人类免疫缺陷病毒抗体、 梅毒螺旋体特异性抗体、 巨噬细胞病毒以及支原体、 细菌和内毒素， 检测结果均呈阴性。 0107 对实施例X46冻存30天并复苏的免疫细胞进行检测， 实施例X4中存活率82.3； 实施例X5中存活率82.8； 实施例X6中存活率83.1。 0108 冻存并复苏的免疫细胞中委托检测平台， 同样检测乙肝表面抗原、 人类免疫缺陷 病毒抗体、 梅毒螺旋体特异性抗体、 巨噬细胞病毒以及支原体、 细菌和内毒素， 检测结果也 均呈阴性。 0109 以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明， 但本发明不限于所描述的实施 方式。 对于本领域的技术人员而言， 在不脱离本发明原理和精神的情况下， 在没有做出创造 性劳动前提下， 对这些实施方式进行多种变化、 修改、 替换和变型， 仍落入本发明的保护范 围内。 说明书 6/6 页 8 CN 111019892 A 8 图1 说明书附图 1/1 页 9 CN 111019892 A 9 。