解螺旋 陪伴医生科研成长 细胞增殖检测实验方法 1. 实验原理 细胞增殖是高等生物体最为重要的生命特征。对于学医的学员而言，高等动物体内的细 胞，主要有两种增殖的方式。第一种是体细胞的增殖方式：有丝分裂。有丝分裂也是最常见 的一种增殖方式。在有丝分裂的过程中，2 倍体的体细胞在经过有丝分裂之后，产生两个都 是2 倍体的后代细胞；另一种是性生殖细胞所采用的增殖方式，被称为减数分裂。减数分裂 最大的特点是，2 倍体的性生殖细胞，经过减数分裂后，形成2 个单倍体的后代细胞。由于 细胞在分裂前是2 倍体，而分裂后变成了单倍体，使得细胞内的染色体数目变成了原先的一 半，因此得名“减数分裂”。增殖是最为常见的表型。学员们也比较熟悉。无论是正常生理 条件下，还是异常的病理条件下，无论是正常的细胞，还是异常的细胞，增殖现象都是普遍 存在的。解螺旋/ 有些分子的表达和增殖的表型有密切的关系，因此，只要能检测到这些特定分子的表达， 就表征了增殖现象的发生。增殖直接相关分子标志物有MCM,细胞核相关抗原Ki-67 和增殖 细胞核抗原PCNA。和干细胞相关的分子标志物如CD44。检测抑癌基因如p53 和PTEN。 在细胞层面上检测和增殖相关的表型，可以用MTT 法、Brdu 法、RTCA 法直接检测细胞 的增殖状态，另外也可以用克隆形成实验或者干细胞悬浮成球试验检测细胞的克隆形成能 力。 在组织层面可以用石蜡切片检测分子标志物或者细胞形态和组织结构上的差异。 在动物层面，可以用移植瘤的动物模型当中，检测增殖相关的分子标志物。另外，可以 在在移植瘤的样本当中，还可以检测细胞的组织形态。 2. 实验目的 在分子、细胞、组织和动物的层面上检测增殖表型。 1 解螺旋 陪伴医生科研成长 3. 实验材料 3.1. 主要试剂 （试剂来源仅供参考） 试剂 来源 Cat.No. RIPA 碧云天 P0013C PMSF Bio-Rad MSB1001 Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 4X Leammli 加样缓冲液 Bio-Rad 1610747 β巯基乙醇 Sigma aldrich 60-24-2 Protein Marker 天能 180-6003 脱脂奶粉 生工 A600669 Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 21059 ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific 32106 Trizol Invitrogen 15596-026 三氯甲烷 Bio-Rad MSB1001 Nuclease-FREE Water Invitrogen AM9938 异丙醇 国药集团化学试剂有限公司 乙醇 国药集团化学试剂有限公司 DEPC 处理的水 碧云天 M-MLV promega M1705 dNTP promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Rnase Inhibitor promega N2115 GXD kit iqSYBR Green Bio-Rad 1708882AP GXD 封膜 Bio-Rad MSB1001 PCR 无色薄壁管（平盖） AXYGEN US-PCR-02-C 解螺旋/ 2 解螺旋 陪伴医生科研成长 3.2. 主要仪器 仪器名称 来源 型号 离心机 Thermo Scientific Micro17R 恒温金属浴 佑宁仪器 MiniH-100L 酶标仪 BioTek Epoch-256600 电泳仪 上海天能 EPS-300 凝胶成像系统 上海天能 Tanon-600 振动切片机 徕卡 VT1200s 生物组织自动包埋机 阔海医疗 KH-BQ qPCR 仪 Biorad CFX96 3.3. 其他（请具体写明） 根据课题组的实际情况选用合适的实验操作。BrdU 溶液需要避光保存在 4℃冰箱，SSC 溶液 也需要4℃保存，可根据实验需要分装后高压灭菌。解螺旋/ 4. 实验步骤 1. Western blot 1.提取组织或细胞蛋白； 2.测定蛋白质浓度 ； 3.电泳：电泳条件为：恒压 100V，待染料前沿移行到距离凝胶底部 2-3mm 时方可停止 （约120min）； 4.电转膜仪转膜 ：转膜条件为：恒流250mA ，2h （时间可根据目的蛋白分子量适当调 整）； 5.封闭：5%脱脂牛奶室温封闭1h； 6.加一抗：一抗封膜之后室温条件下摇1h 然后放入4℃冰箱中过夜； 7.收一抗，PBST 洗膜3 次，10min/次； 8.二抗孵育：室温孵育1h，所用二抗的比例和种属见步骤9）表格。 9.洗膜：PBST 洗膜2 次，PBS 洗膜一次，10min/次。 10.显色 3 解螺旋 陪伴医生科研成长 2. qPCR 1. RNA 抽提（以细胞样品为例，操作步骤同RT-PCR） 1.1 弃去培液，PBS 洗2 遍，加入1ml Trizol，轻轻吹打，直至细胞脱落，吸入1.5 ml EP 管内，静置5 min。（Trizol 量根据细胞密度可适当调整，建议：6 孔板细胞长满~1ml Trizol） 1.2 加入200 μl 氯仿（三氯甲烷），用手剧烈震荡15 秒，室温静置2-3 分钟。（氯仿量为 1/5 Trizol） 1.3 12000g，4℃，离心15min。解螺旋/ 1.4 仔细转移上层水相到1 个新EP 管中，不能贪多，约400-500 μl。 1.5 加等体积异丙醇，轻柔混合4～5 次，室温放置10 分钟。 1.6 12000g，4℃，离心10min。 1.7 轻轻倒去上清，用20 μl 枪轻轻吸去残液，沉淀用1ml 75%乙醇（0.75ml 无水乙醇＋ 0.25ml DEPC 水，现配）洗1～2 次，涡旋混匀。 1.8 吸去上清，5-10 分钟空气干燥RNA。（肉眼不能明显看到水分即可） 1.9 加15-20 μl DEPC 水，吹打数次，测浓度。 注释：mRNA 不稳定，很容易讲解，因此mRNA 提取过程中要尽量避免RNA 酶污染。 2. 反转录（参照商品化试剂盒说明书） 3. 定量PCR 实验（具体参数设置请参照商品化试剂盒说明书） （1）PCR reaction mix 的制备 (在冰上操作)； （2）将8 联管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部； （3）PCR 反应，采用了标准的三步法程序进行反应 （4）在PCR 反应后，进行熔解曲线. 定量PCR 数据分析 4 解螺旋 陪伴医生科研成长 （1）定量PCR 试验原始数据 （2）内参基因在不同样本中的数据分析 （3）目的基因表达量分析 （4） 表达差异的计算 3. MTT 法 1、接种细胞：用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000 个细胞 接种到96 孔板，每孔体积200ul。 2、培养细胞：同一般培养条件，培养3-5 天(可根 据试验目的和要求决定培养时间)。解螺旋/ 3、呈色：培养3-5 天后，每孔加MTT 溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul。继续孵育4 小时，终止 培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加 150ul DMSO，振荡10 分钟，使结晶物充分融解。 4、比色：选择490nm 波长，在酶联免疫监星空体育网站 星空体育首页测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为 横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线. Brdu 染色法 1、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10mu;g/ml。 2、44 小时加秋水仙素，使每ml 中含0.1mu;g。 3、48 小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。 4、常规染色体制片(见第三部分：染色体技术)。 5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6cm 处紫外照射30 分钟。 6、弃去2×SSC 液，流水冲洗。 7、Giemsa 液染色10 分钟，流水冲洗，晾干。 5 解螺旋 陪伴医生科研成长 8、镜检100 个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。 9、计算： 细胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小时) 4. 克隆形成实验 1. 100ml 的1.2%的Argrose 和0.7% Argrose, Argrose 用DNA 电泳用BIOWEST REGULAR O O Argrose G10(4 c)，溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42 c 中不会凝固；配置500ml 的2X1640 和0.005%的结晶紫。 O 2. 实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42 c，提前融化血清和双抗。 3. 如已经制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%的Argrose 下胶和0.7% Argrose 上胶，降 O 温后放入42 c 水浴锅中保持。解螺旋/ 4. 根据实验需要的量配制20% FBS+2X1640+2X PS，每种细胞设置3 个复孔。 5. 铺下胶：按1：1 比例使1.2%的Argrose 下胶和20%FBS+2X1640+2X PS 混合，6 孔盘每 孔迅速加入1.5ml 混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。 对于一个6 孔盘，配5 ml 上述培养液+5 ml 1.2%的Argrose 下胶于50 ml 离心管中（离心 管要一直置于水浴锅中）。 6. 细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞， 4 作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40X10 /ml 以上，这样加的体积小于100ul， 4 不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1 万个细胞，准备4 个孔的细胞数，即4X10 。 7. 铺上胶：按1：1 比例混合0.7% Argrose 上胶和20%FBS+2X1640+2X PS，每种细胞需先 O 配2ml （20%FBS+2X1640+2X PS）+2 ml 0.7% Argrose 上胶于离心管中混匀，放入42 c 水 浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6 孔盘中，每孔1ml。待上 O 层琼脂凝固后，置于5% CO2, 37 c，培养2-3 周。 8. 间隔2 天补加200ul 10% FBS+1640+1X PS，以防过于干燥。 9. 计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100X），在镜下随机选择10 个视野，计数视野 中大于50 个克隆数（0.05 的克隆）和所有克隆数，克隆形成率=大于50 个克隆数\所有克 隆数X100%。每孔加入1ml 的0.005%结晶紫染色1h 以上，镜下拍照。 10. 数据处理：每个视野的面积是1mm2,6 孔盘每孔的面积是9.6cm2,则一个孔中总的克隆 数=平均克隆数×960，如果要比较﹥0.05mm 的克隆的绝对值，则可以利用“每孔﹥0.05mm 6 解螺旋 陪伴医生科研成长
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