1.人原始生殖细胞(hPGC)或来自人多能干细胞的人原始生殖细胞样细胞(hPGCLC)的
维持扩增方法，该方法包括：在(i)佛司可林或磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂、以及(ii)选自碱
性成纤维细胞增殖因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)和上皮生长因子(EGF)的1种以上的
3.权利要求1或2所述的方法，其中，上述细胞因子为LIF和EGF的组合、单独的bFGF、或
4.权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，hPGCLC是经由人初期中胚层样细胞
5.权利要求4所述的方法，其中，hPGCLC是通过在成骨蛋白4(BMP4)、以及任意地选自干
细胞因子(SCF)、LIF和EGF的1种以上的细胞因子的存在下培养hiMeLC 5～8天而诱导的。
6.权利要求1～5中任一项所述的方法，该方法包括：在上述培养中，以hPGC标志物阳性
8.权利要求6或7所述的方法，其中，培养hPGC或hPGCLC至少30天。
9.权利要求1～8中任一项所述的方法，该方法包括：在上述培养中，在进一步包含
10.权利要求9所述的方法，其中，Wnt信号传导抑制剂是促进β‑连环蛋白的分解和/或
11.制造包含hPGC或hPGCLC的细胞群的方法，该方法包括：利用权利要求1～10中任一
12.被扩增的hPGC集团或hPGCLC集团，其是通过权利要求1～10中任一项所述的方法而
13.hPGC或hPGCLC的维持扩增用试剂盒，该试剂盒是包含(a)佛司可林或PDE4抑制剂、
14.权利要求13所述的试剂盒，其中，上述(a)的药剂为佛司可林，上述(b)的细胞因子
15.权利要求13或14所述的试剂盒，该试剂盒进一步包含葡萄糖浓度为1g/L的
16.权利要求13～15中任一项所述的试剂盒，该试剂盒进一步包含Wnt信号传导抑制
17.权利要求13～16中任一项所述的试剂盒，该试剂盒进一步包含抗INTEGRINα6抗体
18.人卵原细胞/原生殖细胞样细胞的制造方法，其包括：将权利要求12所述的hPGC或
工序(3)，将(2)中得到的活细胞分选为hPGC标志物阳性细胞和其以外的细胞；
工序(4)，将(3)中得到的hPGC标志物阳性细胞以外的细胞供于流式细胞术，通过FSC/
工序(5)，根据(3)中得到的hPGC标志物阳性细胞数和(4)中得到的去分化的细胞数，评
20.权利要求19所述的方法，其中，hPGC标志物阳性细胞为BLIMP1和TFAP2C双阳性细
本申请根据2020年8月18日在美国申请的临时申请第63/066,914号和2020年8月
19日在美国申请的临时申请第63/067,776号要求优先权，将其内容引用于此。
信息的连续性和多样性，从而成为规定物种的持久性和进化的基础。在人的情况下，生殖细
胞发育的异常会导致病理状态，包括不育症和子代的遗传或表观遗传疾病，因此生殖细胞
鼠中的生殖细胞的产生在体外的重构。作为其一例，本发明人以前报道了以下的方法：使用
刺激cAMP在细胞内产生的佛司可林和咯利普兰，使小鼠的原始生殖细胞(PGC)/原始生殖细
胞样细胞(PGCLC)在体外增殖(专利文献1、非专利文献1)(以下，有时将小鼠的PGC称为
当的实验系统，迄今为止未充分进行。在这样的状况下，Gell等人报道了：在包含佛司可林
和咯利普兰的培养系统中，在体外培养人的原始生殖细胞样细胞(以下，有时将人的PGCLC
称为“hPGCLC”)(非专利文献2)。然而，Gell等人的报道中的hPGCLC的增殖在10天内为2倍左
因此，本发明的课题是：提供使人的原始生殖细胞(以下，有时将人的PGC称为
本发明人发现：通过在佛司可林和细胞因子的存在下培养所分离的hPGCLC，可维
持扩增hPGCLC。根据本发明的方法，可长期(例如120天以上)培养hPGCLC。由基因表达状态
的分析确认到：通过本发明的方法培养的hPGCLC在保持初期的人PGC的性质的同时增殖。另
外，由基因组DNA甲基化状态的分析判明：hPGCLC大致维持培养期间的DNA甲基化状态。
这与mPGCLC的培养系统(专利文献1、非专利文献1)形成对照，在该培养系统中观
察到增殖所伴随的全基因组(genome‑wide)的DNA的去甲基化，暗示了在人中以不同于小鼠
为了进一步验证已增殖的hPGCLC的功能，本发明人模仿卵巢内环境进行了重构卵
巢培养。其结果确认到：来自hPGCLC的细胞表达DDX4(还作为VASA同系物而已知)或DAZL等
基因，在形态上也分化成具有卵原细胞的特征的卵原细胞样细胞。即，确认到在该培养系统
另外，本发明人在hPGCLC的维持扩增培养中通过使用了hPGC标志物、死细胞星空体育网站 星空体育首页标志
物、人特异性细胞表面抗原的FACS分析测定扩增hPGCLC和去分化的细胞的细胞数，算出扩
增PGCLC细胞数与去分化细胞数之比的对数转换值(enrichment score：富集分数)，从而确
立了评价该培养系统中的hPGCLC的维持扩增效率的方法。另外，还发现了：通过适当选择饲
养细胞，即使不分选来自hPGCLC的细胞和饲养细胞，也可通过分选hPGC标志物阳性细胞和
其以外的细胞，对非hPGC标志物阳性细胞进行FACS分析并附于FSC/SSC双向图，来识别由
而且，本发明人利用该评价法，在上述的hPGCLC的维持扩增培养系统中添加各种
信号传导途径(传导路径)的抑制剂以评价hPGCLC的维持扩增效率(由hPGCLC的去分化率)
时，发现了Wnt信号传导抑制剂、特别是促进β‑连环蛋白的分解和/或抑制核内转移的物质
[1]人原始生殖细胞(hPGC)或来自人多能干细胞的人原始生殖细胞样细胞
(hPGCLC)的维持扩增方法，该方法包括：在(i)佛司可林或磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂、以及
(ii)选自碱性成纤维细胞增殖因子(bFGF，碱性成纤维细胞生长因子)、白血病抑制因子
(LIF)和上皮生长因子(EGF)的1种以上的细胞因子的存在下培养hPGC或hPGCLC。
[3][1]或[2]所述的方法，其中，上述细胞因子为LIF和EGF的组合、单独的bFGF、或
[4][1]～[3]中任一项所述的方法，其中，hPGCLC是经由人初期中胚层样细胞
[5][4]所述的方法，其中，hPGCLC是通过在成骨蛋白4(BMP4)、以及任意地选自干
细胞因子(SCF)、LIF和EGF的1种以上的细胞因子的存在下培养hiMeLC 5～8天而诱导的。
[6][1]～[5]中任一项所述的方法，该方法包括：在上述培养中，以hPGC标志物阳
[9][1]～[8]中任一项所述的方法，该方法包括：在上述培养中，在进一步包含
[10][9]所述的方法，其中，Wnt信号传导抑制剂为促进β‑连环蛋白的分解和/或抑
[13]hPGC或hPGCLC的维持扩增用试剂盒，其是包含(a)佛司可林或PDE4抑制剂、以
[14][13]所述的试剂盒，其中，上述(a)的药剂为佛司可林，上述(b)的细胞因子为
[16][13]～[15]中任一项所述的试剂盒，其进一步包含Wnt信号传导抑制剂。
[16a][16]所述的试剂盒，其中，Wnt信号传导抑制剂为促进β‑连环蛋白的分解和/
[18]人卵原细胞/原生殖细胞样细胞的制造方法，其包含：将[12]所述的hPGC或
工序(3)，将(2)中得到的活细胞分选为hPGC标志物阳性细胞和其以外的细胞；
工序(4)，将(3)中得到的除hPGC标志物阳性细胞以外的细胞供于流式细胞术，通
过FSC/SSC的双向图识别由hPGC或hPGCLC去分化的细胞和饲养细胞；以及
工序(5)，根据(3)中得到的hPGC标志物阳性细胞数和(4)中得到的去分化的细胞
[19b][19]或[19a]所述的方法，其中，工序(5)中的评价根据下式所表示的富集分
(a)在候选物质的存在下或不存在下，在饲养细胞上、于规定条件下培养hPGC或
(c)在候选物质的存在下的维持效率高于在候选物质的不存在下的维持效率的情
[22]PGC或PGCLC的维持扩增方法，其包括：在Wnt信号传导抑制剂的存在下培养
[22a][22]所述的方法，其中，培养是在进一步包含佛司可林和/或PDE4抑制剂的
[22b][22]所述的方法，其中，PGC或PGCLC为人细胞，培养在下述条件下进行：
[22c][22]所述的方法，其中，PGC或PGCLC为非人动物细胞，培养在下述条件下进
[23]抑制PGC或PGCLC的去分化的方法，其包括：在PGC或PGCLC的维持扩增培养中，
[23a][23]所述的方法，其中，培养是在进一步包含佛司可林和/或PDE4抑制剂的
[23b][23]所述的方法，其中，PGC或PGCLC为人细胞，培养是在下述条件下进行：
[23c][23]所述的方法，其中，PGC或PGCLC为非人动物细胞，培养是在下述条件下
[25]PGCLC的制造方法，其包括：在Wnt信号传导抑制剂的存在下，将多能干细胞
根据本发明的方法，可长期(例如120天以上)培养hPGC或hPGCLC，使扩增100万倍
[图1A]在体外探讨使hPGCLC扩增的条件。(A)在m220‑5饲养细胞上的诱导和培养
[图1B]在体外探索使hPGCLC扩增的条件。(B)(左)用于探索使BT
件的图示。(右)显示在通过FACS分析确定的指定条件下培养10天后的BT
细胞增殖的化学物质的组合[佛司可林(10μM)、咯利普兰(10μM)和环孢菌
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF：20ng/ml)]。使用约5000个hPGCLC作为起始细胞群。因环孢
均差异倍数(fold change，倍数变化)用横杠表示。mPGCLC扩增的条件：绿色。没有其他化学
的结果。使用约5000个hPGCLC作为起始细胞群(培养天数0：c0)，将在c10、c20和c30的传代
结果。使用约5000个hPGCLC作为起始细胞群(培养天数0：c0)，将在c10、c20和c30的传代中
浮雕反差和荧光(BT)图像的典型例子。显示C21、23、25、27、29和30中的图像。在中央版面
(panel)的c30中用四边形围起来的部分的放大图是右端的版面。箭头表示具有典型形态的
[图2A]在体外的指定条件下的hPGCLC的长期增殖。(A)hPGCLC诱导的d6和在包含
[图2B]在体外的指定条件下的hPGCLC的长期增殖。(B)到c120为止的BT
胞的扩增培养的浮雕反差(左)和荧光图像[BT(中央)和AG(右)]。在板上进行二维培养AG
[图2E]在体外的指定条件下的hPGCLC的长期增殖。(E)用两联实验中的到c120为
细胞的生长曲线个hPGCLC作为起始细胞群，在各传代中再接种10,000个BT
[图2F]在体外的指定条件下的hPGCLC的长期增殖。(F)在c28[低倍率(左)和高倍
用DAPI(白色)进行对比染色。关于c28[低倍率]，合并后的图像见右端。比例尺为20μm。
扩增培养期间显示出的基因表达的定量PCR(qPCR)分析。对于所试验的各基因，由2个独立
的作为管家基因的RPLP0和PPIA(设定为0)的平均Ct值来计算ΔCt，对2个独立试验作图。用