本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种免疫细胞扩增方法与免疫细胞培养基。
免疫细胞治疗已成为全世界医疗领域内对难治性疾病(如恶性肿瘤)进行治疗的新的重要医疗手段，比如采用car-t细胞对b细胞淋巴瘤进行治疗。对科学界和医疗界而言，获得质量稳定可靠、功能优良的免疫细胞对获得良好的临床治疗效果非常关键。
人vγ9vδ2t细胞是仅存在于灵长类和人中的一类具有抗肿瘤、抗感染功能的t细胞亚群。人vγ9vδ2t细胞可用于患有肿瘤、难治性传染病及免疫功能失衡疾病的人群的免疫细胞治疗或免疫功能重建。
第一类现有扩增技术是在外周血单核细胞(pbmcs)的培养基中添加il-2和tcrγδ的单克隆抗体。这种方法的主要缺点是外周血中的两类γδt细胞(vδ1细胞亚群和vδ2细胞亚群)都被扩增，而vδ1细胞亚群具有免疫抑制功能，因此不适用于免疫细胞治疗。
第二类现有扩增技术是在pbmcs的培养基中添加il-2和磷酸盐小分子化合物如唑来膦酸。这种方法可以得到纯度较高的vδ2亚群的γδt细胞，可以用于免疫细胞治疗，这是目前国内外扩增人外周血人vγ9vδ2t细胞的常用方法。但是该方法的缺点是：细胞培养扩增的周期为14天左右，扩增出来的人vγ9vδ2t细胞的存活时间较短(能继续存活7天左右)，细胞抗凋亡能力不强，对肿瘤细胞的杀伤能力不强等。
本发明的目的首先在于提供一种免疫细胞扩增方法，能够提高人vγ9vδ2t细胞的增殖效率与细胞纯度，培养得到的人vγ9vδ2t细胞的抗凋亡能力较强，细胞存活时间长，同时对肿瘤细胞的杀伤能力较强。
本发明的目的还在于提供一种免疫细胞培养基，采用该培养基对人vγ9vδ2t细胞进行培养，能够提高人vγ9vδ2t细胞的增殖效率与细胞纯度，培养得到的人vγ9vδ2t细胞的抗凋亡能力较强，细胞存活时间长，同时对肿瘤细胞的杀伤能力较强。
本发明的目的还在于提供一种免疫细胞刺激扩增培养基，能够从外周血单个核细胞中选择性的扩增出人vγ9vδ2t细胞，扩增得到的人vγ9vδ2t细胞的纯度高，杀伤能力与抗凋亡能力较强。
步骤2、提供免疫细胞刺激扩增培养基，采用所述免疫细胞刺激扩增培养基对所述外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；
所述免疫细胞刺激扩增培养基包括免疫细胞培养基以及添加于所述免疫细胞培养基中的膦酸类化合物；所述免疫细胞培养基包括基础培养基以及添加于所述基础培养基中的白介素-2、白介素-15以及维生素e；
步骤4、采用所述免疫细胞培养基进行换液，后续培养过程均采用所述免疫细胞培养基进行。
可选的，所述基础培养基为rpmi-1640培养基；所述膦酸类化合物包括唑来膦酸、依替膦酸、伊班膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、米罗磷酸中的一种或多种。
可选的，所述步骤2中，所述免疫细胞刺激扩增培养基中，膦酸类化合物的浓度为1-1000μm；
所述免疫细胞刺激扩增培养基与所述免疫细胞培养基中，白介素-2的浓度为1-1000ng/ml，白介素-15的浓度为1-1000ng/ml，维生素e的浓度为100μm-600mm。
可选的，所述细胞培养容器为24孔板、48孔板或96孔板；所述步骤3中，将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中培养72小时；所述步骤4的后续培养过程中，每隔48-72小时对细胞进行换液。
本发明还提供一种免疫细胞培养基，包括基础培养基以及添加于所述基础培养基中的白介素-2、白介素-15以及维生素e。
可选的，所述免疫细胞培养基中，白介素-2的浓度为1-1000ng/ml，白介素-15的浓度为1-1000ng/ml，维生素e的浓度为100μm-600mm。
本发明还提供一种免疫细胞刺激扩增培养基，包括免疫细胞培养基以及添加于所述免疫细胞培养基中的膦酸类化合物。
可选的，所述免疫细胞刺激扩增培养基中，膦酸类化合物的浓度为1-1000μm。
(1)与传统的扩增方法(第二类扩增技术)相比，本发明的扩增方法中人vγ9vδ2t细胞的增殖效率更快且细胞纯度更高，在(从步骤3开始)培养10-12天时，即可达到95％的细胞纯度，细胞扩增比率达到1200倍以上，显著缩短了人vγ9vδ2t细胞扩增培养周期；
(2)与传统的扩增方法(第二类扩增技术)得到的人vγ9vδ2t细胞相比，本发明扩增得到的人vγ9vδ2t细胞的杀伤性功能因子nkg2d、ifn-γ、tnf-α、cd107a的表达水平更高，从而对肿瘤细胞的杀伤能力更强；
(3)本发明扩增得到的人vγ9vδ2t细胞的抗凋亡能力更强，存活时间更长，并且，在细胞扩增培养周期(从步骤3开始10-12天)结束后，本发明扩增得到的人vγ9vδ2t细胞能继续存活23天。
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。
图1为采用四种不同的培养基对人vγ9vδ2t细胞进行扩增培养的增殖效率对比图；
图2为采用四种不同的培养基对人vγ9vδ2t细胞进行扩增后得到的人vγ9vδ2t细胞的凋亡率对比图；
图3为采用四种不同的培养基对人vγ9vδ2t细胞进行扩增后得到的人vγ9vδ2t细胞的关键杀伤分子nkg2d表达水平对比图；
图4a为采用四种不同的培养基对人vγ9vδ2t细胞进行扩增后得到的人vγ9vδ2t细胞的γ干扰素表达水平对比图；
图4b为采用四种不同的培养基对人vγ9vδ2t细胞进行扩增后得到的人vγ9vδ2t细胞的α肿瘤坏死因子表达水平对比图；
图5为采用四种不同的培养基对人vγ9vδ2t细胞进行扩增后得到的人vγ9vδ2t细胞的cd107a表达水平对比图。
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说a组分的质量份为a份，b组分的质量份为b份，则表示a组分的质量和b组分的质量之比a：b。或者，表示a组分的质量为ak，b组分的质量为bk(k为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，a和/或b包括(a和b)和(a或b)；
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
步骤2、提供免疫细胞刺激扩增培养基，采用所述免疫细胞刺激扩增培养基对所述外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；
所述免疫细胞刺激扩增培养基包括免疫细胞培养基以及添加于所述免疫细胞培养基中的膦酸类化合物；所述免疫细胞培养基包括基础培养基以及添加于所述基础培养基中的白介素-2(il-2)、白介素-15(il-15)以及维生素e(vitamine)。
步骤4、采用所述免疫细胞培养基进行换液，后续培养过程均采用所述免疫细胞培养基进行。
具体的，所述步骤1中，所述基础培养基为rpmi-1640培养基。rpmi是roswellparkmemorialinstitute的缩写，代指洛斯维·帕克纪念研究所。rpmi是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号，其中含有10％胎牛血清。
可选的，所述膦酸类化合物包括唑来膦酸(zoledronate,zol)、依替膦酸、伊班膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、米罗磷酸中的一种或多种。
具体的，所述步骤2与步骤3的目的在于：通过采用含有膦酸类化合物的免疫细胞刺激扩增培养基对所述外周血单个核细胞进行培养，选择性的对所述外周血单个核细胞中的vγ9vδ2t细胞进行扩增，并且抑制其它细胞的生长，使其它细胞凋亡。
所述步骤4的目的在于对所述步骤3选择性扩增出的纯度较高的vγ9vδ2t细胞进行进一步扩增，以增加vγ9vδ2t细胞的数量。
具体的，所述步骤2中，所述免疫细胞刺激扩增培养基中，膦酸类化合物的浓度为1-1000μm；
所述免疫细胞刺激扩增培养基与所述免疫细胞培养基中，白介素-2的浓度为1-1000ng/ml，白介素-15的浓度为1-1000ng/ml，维生素e的浓度为100μm-600mm。
具体的，所述步骤3与步骤4的总培养时间通常为10-12天，这个时间点的细胞数量充足并且杀伤能力最强，尤其适用于进行细胞治疗。
本发明的免疫细胞扩增方法中，未注明具体条件的操作方法均按常规条件(如《精编分子生物学实验指南》(f.m.奥斯伯，r.e.金斯顿，j.g.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004))中所述的方法进行。
本发明的关键技术特征在于在细胞培养过程中白介素-15和维生素e的使用，通过在人vγ9vδ2t细胞的扩增培养过程中添加白介素-15和维生素e，与传统的扩增方法(第二类扩增技术)相比，能够提高人vγ9vδ2t细胞的增殖效率与细胞纯度，培养得到的人vγ9vδ2t细胞的抗凋亡能力更强，细胞存活时间更长，并且杀伤性功能因子nkg2d、ifn-γ、tnf-α、cd107a的表达水平更高，从而对肿瘤细胞的杀伤能力更强。相对于现有的第二类扩增技术(详见背景技术介绍)来说，本发明解决了比如扩增效率低及纯度低的问题、所获得细胞的杀伤功能不强的问题以及所获得细胞存活时间不够、易衰老、易凋亡等技术问题。
(1)与传统的扩增方法(星空体育网站 星空体育首页第二类扩增技术)相比，本发明的扩增方法中人vγ9vδ2t细胞的增殖效率更快且细胞纯度更高，在(从步骤3开始)培养10-12天时，即可达到95％的细胞纯度，细胞扩增比率达到1200倍以上，显著缩短了人vγ9vδ2t细胞扩增培养周期；
(2)与传统的扩增方法(第二类扩增技术)得到的人vγ9vδ2t细胞相比，本发明扩增得到的人vγ9vδ2t细胞的杀伤性功能因子nkg2d、ifn-γ、tnf-α、cd107a的表达水平更高，从而对肿瘤细胞的杀伤能力更强；
(3)本发明扩增得到的人vγ9vδ2t细胞的抗凋亡能力更强，存活时间更长，并且，在细胞扩增培养周期(从步骤3开始10-12天)结束后，本发明扩增得到的人vγ9vδ2t细胞能继续存活23天。
基于上述免疫细胞扩增方法，本发明还提供一种免疫细胞培养基，包括基础培养基以及添加于所述基础培养基中的白介素-2、白介素-15以及维生素e。
可选的，所述免疫细胞培养基中，白介素-2的浓度为1-1000ng/ml，白介素-15的浓度为1-1000ng/ml，维生素e的浓度为100μm-600mm。
本发明还提供一种免疫细胞刺激扩增培养基，包括如上文所述的免疫细胞培养基以及添加于所述免疫细胞培养基中的膦酸类化合物。
可选的，所述免疫细胞刺激扩增培养基中，膦酸类化合物的浓度为1-1000μm。
图1为采用四种不同的培养基对人vγ9vδ2t细胞进行扩增培养的增殖效率对比图。
图1中，il2表示整个扩增培养过程中采用的是在基础培养基的基础上添加il2+il15后得到的培养基；
il2+ve表示整个扩增培养过程中采用的是在基础培养基的基础上添加il2+ve后得到的培养基；
il2+il15表示整个扩增培养过程中采用的是在基础培养基的基础上添加il2+il15后得到的培养基；
il2+il15+ve表示整个扩增培养过程中采用的是在基础培养基的基础上添加il2+il15+ve后得到的培养基；
在前期的刺激扩增阶段(步骤2与步骤3)，上述四种培养基方案中均添加zol。
如图1所示，采用上述四种培养基分别对人vγ9vδ2t细胞进行扩增后，得到的数据显示，没有添加il15的培养基(il2与il2+ve)的细胞增殖效率较低，而添加了il15的培养基(il2+il15与il2+il15+ve)的细胞增殖效率较高，由此可以看出，il-15的添加能够显著提高人vγ9vδ2t细胞的增殖效率(ki67蛋白表达上升)，而il15与维生素e联用则能够进一步提升人vγ9vδ2t细胞的增殖能力。
图2为采用四种不同的培养基对人vγ9vδ2t细胞进行扩增后得到的人vγ9vδ2t细胞的凋亡率对比图，图2中il2、il2+ve、il2+il15、il2+il15+ve表示的含义与图1相同。
从图2中可以看出，在培养基中添加ve能够显著降低细胞的凋亡比例和凋亡速度，另外，il-15与ve联用能够更加显著的增强细胞抗凋亡能力。
图3为采用四种不同的培养基对人vγ9vδ2t细胞进行扩增后得到的人vγ9vδ2t细胞的关键杀伤分子nkg2d表达水平对比图，图3中il2、il2+ve、il2+il15、il2+il15+ve表示的含义与图1、图2相同。
从图3中可以看出，il-15与ve联用能够使人vγ9vδ2t细胞的关键杀伤分子nkg2d实现高水平表达，也即是说，il-15与ve联用的配方(即本发明的技术方案)能够使人vγ9vδ2t细胞具备高杀伤能力。
图4a为采用四种不同的培养基对人vγ9vδ2t细胞进行扩增后得到的人vγ9vδ2t细胞的γ干扰素表达水平对比图，图4b为采用四种不同的培养基对人vγ9vδ2t细胞进行扩增后得到的人vγ9vδ2t细胞的α肿瘤坏死因子表达水平对比图。
从图4a与图4b可以看出，维生素e能够显著提升人vγ9vδ2t细胞中杀伤性功能分子的分泌量，所述杀伤性功能分子包括γ干扰素(ifn-γ)与α肿瘤坏死因子(tnf-α)；而维生素e与il15联用能够进一步提升这些功能分子的分泌，从而增强人vγ9vδ2t细胞对靶细胞的杀伤能力。
图5为采用四种不同的培养基对人vγ9vδ2t细胞进行扩增后得到的人vγ9vδ2t细胞的cd107a表达水平对比图，cd107a是表示细胞杀伤活力的标志分子，该分子表达水平升高，表明细胞的杀伤能力也升高；从图5可以看出，il15可以提升人vγ9vδ2t细胞中cd107a的表达水平，并且il15与ve具有协同作用，二者联用能够显著提升cd107a的表达水平，从而提升人vγ9vδ2t细胞的杀伤活力。
值得一提的是，本申请发明人通过大量实验研究发现，在配方为il2+il15+维生素的培养基方案中，仅有维生素e能够同时提升人vγ9vδ2t细胞中nkg2d、γ干扰素(ifn-γ)、α肿瘤坏死因子(tnf-α)、cd107a的表达水平，这一技术效果是其它维生素所不能实现的，这也充分说明了本发明技术方案具有突出的技术效果。
下面以具体实施例的形式对本发明的免疫细胞培养基与免疫细胞刺激扩增培养基进行详细描述。
该实施例1提供一种免疫细胞培养基，包括rpmi-1640培养基以及添加于所述rpmi-1640培养基中的白介素-2、白介素-15以及维生素e。
其中，所述免疫细胞培养基中，白介素-2的浓度为200ng/ml，白介素-15的浓度为400ng/ml，维生素e的浓度为200mm。
该实施例2提供一种免疫细胞培养基，包括rpmi-1640培养基以及添加于所述rpmi-1640培养基中的白介素-2、白介素-15以及维生素e。
其中，所述免疫细胞培养基中，白介素-2的浓度为400ng/ml，白介素-15的浓度为500ng/ml，维生素e的浓度为300mm。
该实施例3提供一种免疫细胞刺激扩增培养基，包括如实施例1所述的免疫细胞培养基以及添加于所述免疫细胞培养基中的唑来膦酸。
该实施例4提供一种免疫细胞刺激扩增培养基，包括如实施例2所述的免疫细胞培养基以及添加于所述免疫细胞培养基中的唑来膦酸。
由于本发明中所涉及的各工艺参数的数值范围在上述实施例中不可能全部体现，但本领域的技术人员完全可以想象到只要落入上述该数值范围内的任何数值均可实施本发明，当然也包括若干项数值范围内具体值的任意组合。此处，出于篇幅的考虑，省略了给出某一项或多项数值范围内具体值的实施例，此不应当视为本发明的技术方案的公开不充分。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式选择等，落在本发明的保护范围内。
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