从液氮罐中取出冻存的PK-15细胞(约1.8 m L)迅速放入40 ℃水浴锅中(大约2 min)使其溶解,然后放入离心机中1 000 rpm,离心5 min,弃冻存液,用1 m L吸管,吸培养液使细胞重新悬浮,吹打细胞,全部移入培养瓶,放37 ℃ CO2培养箱培养24 h,显微镜观察结果:细胞都贴壁生长,均匀平铺在瓶壁上,形状源自文库齐、轮廓清晰,在无菌操作台,把细胞培养瓶中的营养液倒掉,换维持液,培养24 h,把原培养瓶中的维持液倒掉,把消化液分三次加入细胞培养瓶中,每次从细胞贴壁的一面开始消化(轻摇) ,四面都洗完,把消化液倒掉,把培养液加入培养瓶,分装成两瓶。继续按上述步骤进行细胞传代培养。
随着畜牧业的高速发展,养殖规模的不断扩大,动物疫病也成为困扰广大养殖户的首要问题。检测出明确的疫病类型,是做好养殖业防控治疗的关键。对发病毒株的更深一步的研究,可有助于研制适于当前流行疫病的疫苗和药物制剂。这样,病毒前期的分离培养就尤为重要,因为病毒缺乏完整的酶系统,又无核糖体等细胞器,所以不能在任何无生命的培养液内生长。试验动物、鸡胚以及体外培养的组织细胞就成为人工增殖的基本工具。细胞培养与实验动物和鸡胚相比,不仅经济、方便、省时、省力,而且能提供大量生物性稳定的细胞群体,降低了外界因素的影响,使实验结果更加准确可靠。
5)不同的病毒,会有自己所敏感的增殖细胞。因此,实际工作中,我们要根据自己所研究的病毒,选择适宜的培养细胞。病毒传到多少代可以达到稳定状态,不同的病毒也会不同,要根据具体试验结果而定。
1)培养液配制时,采用的动物血清是细胞生长所必须的营养物质,有很强的酸碱缓冲作用和促进细胞贴壁的作用。一般采用犊牛血清,但不是所有病毒都通用一种血清,比如犊牛血清就抑制细小病毒的生长,要改为5月龄以内的胎牛血清。所以,根据所增殖病毒的不同,加入其适宜的血清。营养液的p H值,细胞最适生长的p H范围是7.0-7.4,细胞通常可耐受p H 6.6-7.8较大范围的变化,偏酸或偏碱的环境持续时间不宜超过24 h,否则细胞很快老化。较碱的生长液更适于细胞贴壁,但培养时的p H应保持在7.2-7.4之间。
2)培养细胞所用培养瓶,移液管等玻璃器皿洁净与否,对于细胞培养十分重要。必须经清水冲洗,再于1%优质洗衣粉的水溶液内蒸煮30 min,随后刷洗,并用清水和蒸馏水分别冲洗5~6次以上,烘干。然后经包扎于160~170 ℃干燥灭菌2 h,取出备用。
3)细胞培养和接毒后培养的内外环境一定要保持无菌,工作前后要紫外灯半小时杀菌,尤其是环境中不要感染支原体,否则,细胞培养将无法继续。
摘要：细胞培养是病毒学实验研究必不可少的重要工具和手段。本文以猪乙型脑炎病毒在猪肾上皮细胞(PK-15细胞)增殖培养为例,介绍一下病毒的细胞培养方法,和一些注意事项。
干燥箱、恒温培养箱、普通冰箱、-80 ℃低温冰柜、高压消毒器、恒温水浴箱、普通离心星空体育 星空体育平台机、真空泵、蔡氏星空体育 星空体育平台滤器、显微镜、无菌室、超净工作台、细胞培养瓶、移液管(1 m L、5 m L、10 m L)等。
1.2.1营养液的配制营养液是组织细胞中赖以生长和增殖的直接环境,不仅要求含有多种营养物质,而且必须保证适宜酸碱度、温度、渗透压和气相等。以配制10 m L营养液为例:需灭菌蒸馏水7.8 m L、EME0.9 m L、双抗(青霉素和链霉素) 0.2 m L、犊牛血清1 m L、Na 0.1 m L,调p H值7.2-7.4。
4)一般细胞培养到5代以后,可以进行接毒。病毒传代到13代以后基本稳定,可以作为下一步试验用毒。一般在接毒培养瓶内约有2/3的细胞发生折光性增强、凝缩不整及细胞核变形、破碎、脱落时,应立即收获。在实际工作中,往往因病料中病毒含量少或病毒起初不适应在细胞内增殖,初代分离病变不明显,但通过盲传而逐步增强,从而达到分离病毒的目的。
取处理好的病毒组织, 12 000 rpm离心10 min,取上清接种于倒掉培养液的细胞培养瓶中, 37 ℃感作1 h (每隔15 min慢慢摇动一次,使病毒与细胞充分作用) ;同时做空白对照。1 h后,把接毒瓶与对照瓶同时加维持液(维持液调p H 7.6) ,放37 ℃温箱,解毒12 h后,接毒细胞无明显变化,相对于对照细胞,维持液稍黄, 16 h后,维持液开始变浑浊,接毒20 h后细胞有了明显变化,细胞界限模糊不清晰,细胞的生长受到抑制,有些细胞有融合现象,已有两个或三个细胞融合为一个细胞(这时,要在接毒细胞和对照细胞中均加入2 m L Na HCO3,调环境p H7.5-7.7,要使维持液保持一定的p H环境) ,接毒24 h后,接毒细胞形状变细长, 36 h后90%细胞已经圆缩,开始收毒,收的乙脑细胞毒放-80 ℃低温冰柜冻36 h,然后拿出冻融一次(-80 ℃病毒放4 ℃冰箱2 min,然后融化再放入-80 ℃冰柜) , 3 h后,取出病毒按上步骤融化分装,为第一代病毒。取第一代病毒接种细胞,按以上操作步骤进行传代。传代到十代以上,可以保存病毒作为下一步试验用毒。