目录中文摘要 英文摘要 前言……………………………………………………………………………………‘１ 日Ｕ舌…………………………………………………………………………………… 一、材料与方法………………………………………………………………………一５ ｌ材料 １．１菌种和质粒………………………………………………………………………．５ １．１．１腺病毒载体系统…………………………………………………………………５ １．１．２ Ｅｃｏｌｉ ＤＨ５ａ………………………………………………………………………．６ １．１．３ ｐＲＥＰ４质粒………………………………………………………………………．６ １．２酶、主要试剂和仪器……………………………………………………………．．６ １．２．１酶和主要购买试剂……………………………………………………………．６ １．２．２自配试剂………………………………………………………………………。７ １．２．３仪器………………………………………………………………………………．８ １．３细胞、培养基及培养条件…………………………………………………………８ １．３．１人胚胎肾细胞２９３Ｔ………………………………………………………………８ １．３．２人鼻咽癌细胞ＣＮＥ……………………………………………………………。８ １．３．３大肠杆菌ＢＪ５１８３和Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ………………………………………………．９ １．３．４人胃腺癌细胞ＳＧＣ．７９０１………………………………………………………．９ １．３．５抗生素与浓度……………………………………………………………………９ ２方法 ２．１ ｐＲＥＰ４上ＭＤＡ．７的鉴定以及穿梭质粒上ＭＤＡ．７的搭载构建………………．９ ２．１．１ ３Ｓ柱离心式质粒小量快速抽提法……………………………………………．９ ２．１．２酶切以及质粒片段的连接……………………………………………………１０ ２．１．３电泳、胶回收…………………………………………………………………。ｌＯ ２．１．４ Ｅｃｏｌｉ ＤＨ５ａ的感受态制作、菌种保存和ＣａＣｌ２法转化……………………．１１ ２．１．５ ＰＣＲ反应体系…………………………………………………………………．１１ ２．２ ｐＡｄ．ｍｄａ７与ｐＡｄ．ＧＦＰ质粒的获得……………………………………………．．１２ ２．２．１质粒碱法抽提…………………………………………………………………１２ ２．２．２超薄琼脂糖凝胶回收…………………………………………………………１３ ２．２．３电转化感受态细胞ＢＪ５１８３的制备以及电转化………………………………１３ ２．２．４穿梭质粒ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶ与腺病毒骨架质粒ＡｄＥａｓｙ－ｌ的同源重组………．１４
２．２．５重组病毒质粒的鉴定和保存…………………………………………………．１４ ２．３细胞转染和病毒生产、滴度测定………………………………………………．１６ ２．３．１细胞复苏………………………………………………………………………．１６ ２．３．２细胞传代培养…………………………………………………………………。１６ ２．３．３细胞冻存………………………………………………………………………．１６ ２．３．４细胞转染………………………………………………………………………．１７ ２．３．５腺病毒的收取…………………………………………………………………．１７ ２．３．６腺病毒滴度测定………………………………………………………………．１７ ２．４ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８凋亡染色和流式细胞仪检测……………………………………１８ ２．４．１ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８凋亡染色………………………………………………………．１８ ２．４．２流式细胞仪ＰＩ染色检测细胞周期……．：……………………………………．１８ 二．结果………………………………………………………………………………．２０ ｌｐＲＥＰ４上ＭＤＡ．７基因的鉴定 １．１ ＭＤＡ．７基因的测序结果…………………………………………………………２０ １．２ ｐＲＥＰ４上ＭＤＡ．７的ＫｐｎＩ＋ＸｈｏＩ双酶切鉴定结果……………………………．２１ ２穿梭质粒ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶ－ｍｄａ７的构建 ２．１ ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶ和ｐＲＥＰ４的ＫｐｎＩ＋ＸｈｏＩ双酶切结果…………………………．２ｌ ２．２ ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶ－ｍｄａ７的双酶切鉴定结果………………………………………２２ ３重组病毒质粒ｐＡｄ．ｍｄａ７和ｐＡｄ．ＧＦＰ的构建 ３．１重组病毒质粒ｐＡｄ．ｍｄａ７和ｐＡｄ．ＧＦＰ的尸口以酶切结果……………………．２２ ３．２重组病毒质粒ｐＡｄ．ｍｄａ７和ｐＡｄ．ＧＦＰ的ＰＣＲ鉴定结果……………………．．２３ ４细胞转染和病毒滴度测定 ４．１ ２９３Ｔ的细胞转染…………………………………………………………………２４ ４．２ ２９３Ｔ的二次病毒感染…………………………………………………………．．２５ ４．３ ２９３Ｔ的多次病毒感染……………………………………………………………２５ ４．４病毒滴度测定……………………………………………………………………．２６ ５人鼻咽癌细胞ＣＮＥ相关检测结果 ５．１ ＣＮＥ细胞生长形态……………………………………………………………．．２７ ５．２ ＣＮＥ细胞Ｈｏｅｃｈｓｔ染色结果……………………………………………………３ｌ ５．３ ＣＮＥ流式细胞仪检测结果……………………………………………………．．３ｌ ５．３．１ ＳｕｂＧｌ期检测结果……………………………………………………………．．３ｌ ５．３．２ Ｇ２／Ｍ Ｂｌｏｃｋ期检测结果………………………………………………………．３２ ６人胃腺癌细胞ＳＧＣ．７９０１相关检测结果
６．１ ＳＧＣ．７９０１细胞的生长形态……………………………………………………．．３５ ６．２ ＳＧＣ．７９０１ Ｈｏｅｃｈｓｔ染色结果……………………………………………………３９ ６．３ ＳＧＣ．７９０１流式细胞仪检测结果………………………………………………．３９ 三、讨论………………………………………………………………………………４ｌ 四、参考文献…………………………………………………………………………４４ 五、论文发表情况……………………………………………………………………４９ 六、致谢……………………………………………………………………………．．５０
摘要 摘要 ＭＤＡ一７（ｍｅｌａｎｏｍａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ一７，黑色素瘤分化相关 基因７），又称ＩＬ－２４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２４，白介素２４），是Ｊｉａｎｇ等利用差减杂交法 从Ｂ干扰素（ＩＦＮ－Ｂ）和瑞香素（ＭＥＺ）诱导的终端分化人类黑色素瘤细胞中克 隆到的基因，后来根据其基因结构和免疫功能特点将其重新命名为白介素２４ （ＩＬ－２４）。现有实验证明在超生理水平的表达下ＭＤＡ一７对多种肿瘤细胞有明显的 生长抑制和凋亡诱导作用，而对相应的正常细胞没有凋亡诱导作用，并且同时具 免疫激活、抗血管生成、提高放化疗敏感性等作用，在体内和体外试验中都取得 了明显的实验效果，具有广泛的癌症治疗前景和预期。 鼻咽癌病人虽然见于五大洲的许多国家和地区，但世界大部分地区发病率较 低，一般在１／１０万以下，其发病有着明显的区域性和种族差异，好发于黄种人 而白种人少见，所以尽管ＭＤＡ－７针对如乳腺癌、肝癌、直肠癌等已有较多研究结 果，但鼻咽癌作为中国且中国南方多发的癌症，目前国内外少有ＭＤＡ一７基因针对 其凋亡作用的研究。而且已有的研星空体育登录入口 星空体育在线官网究结果表明，ＭＤＡ一７基因并非对所有肿瘤细胞 系都有良好的凋亡诱导作用，一些细胞系比如胰腺癌细胞和某些肺癌细胞就具有 针对ＭＤＡ－７基因的抗性作用。 腺病毒载体是一种目前应用比较广泛的载体，虽然构建上相比其他病毒载体 显得复杂，但因其安全性、稳定性以及良好的细胞感染和表达效率而得到应用， 通过将目的基因片段克隆整合到重组腺病毒基因组上（如Ａｄ—ＧＦＰ，Ａｄ—ｌｕｃ等）， 来实现目的基因针对靶细胞靶组织的导入，以及相应蛋白的表达和作用。 本实验利用重组人５腺病毒载体（复制缺陷型）构建搭载ＭＤＡ一７基因的重组 病毒Ａｄ—ｍｄａ７及空病毒Ａｄ－ＧＦＰ，用ＨＥＫ ２９３Ｔ细胞对病毒进行生产和扩增，得到 的重组病毒经滴度测定后定量的用于人鼻咽癌细胞ＣＮＥ的凋亡研究。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８凋亡染色结果表明：Ａｄ—ｍｄａ７处理组相比Ａｄ—ＧＦＰ和ＰＢＳ处理组，ＣＮＥ细胞 呈明显的凋亡染色形态。流式细胞仪ＰＩ染色检测结果表明：重组病毒Ａｄ—ｍｄａ７ 相比空病毒Ａｄ－ＧＦＰ以及ＰＢＳ处理组，对ＣＮＥ细胞有较明显的凋亡诱导作用，可 以观察到相应的ＳｕｂＧｌ期和Ｇ２／Ｍ Ｂｌｏｃｋ期细胞比例的累积。以上实验和结果为 今后鼻咽癌的研究治疗以及相应ＭＤＡ一７基因的应用提供了实验依据。 关键词：重组腺病毒；ＭＤＡ．７；鼻咽癌 中图分类号：Ｑ２５５，Ｒ３７３
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ａｂｓｔｒａｃｔ ＭＤＡ－７（ｍｅｌａｎｏｍａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ－７）， ａｌｓｏ ｋｎｏｗｎ ａｓ ＩＬ・ ２４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２４），ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ Ｊｉａｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＨＯ一１ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ丽ｍ ＩＦＮ－ｐ ａｎｄ ＭＥＺ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｌａｔｅｒ ｉｔ ｗａｓ ｒｅ－ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ嬲Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２４（ＩＬ－２４）ｂｙ ｉｔｓ ｇｅｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｎｏｗａｄａｙｓ ｉｔ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｓｕｐｒａｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｅｖｅｌ’Ｓ ＭＤＡ・ ７ Ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ，ｂｕｔ ｈａｓ ｎｏ ｓｉｍｉｌａｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ａｌｓｏ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，ｅｔｃ．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｒｅ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｆｒｏｍ ｂｏｎｌ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｔ ｈａｓ ｂｒｏａｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ａｌｔｈｏｕｇｈ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｃａｎ ｂｅ ｓｅｅｎ ｉｎ ｍａｎｙ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ ａｎｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｃｏｎｔｉｎｅｎｔｓ，ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｉｓ ｖｅｒｙ ｓｍａｌｌ ｉｎ ｍｏｓｔ ｐａｒｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｕｓｕａｌｌｙ ｂｅｌｏｗ １／１００，０００ ａｎｄ ｉｔ ｈａｓ Ｒｅｇｉｏｎａｌ ａｎｄ ｅｔｈｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ， ｓｉｎｃｅ ｉｔ’Ｓ ｓｅｅｎ ｍｏｒｅ ｉｎ Ａｓｉａｎ ｔｈａｎ ｉｎ Ｃａｕｃａｓｉａｎ ｐｅｏｐｌｅ．Ｓｏ ａｌｔｈｏｕｇｈ ｔｈｅｒｅ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｍｕｃｈ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒｅｔｃ，ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｓ ａｃｏｍｍｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｔｈｅ ｓｏｕｔｈ ｏｆ Ｃｈｉｎａｈａｓｎ’ｔ ｂｅｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＭＤＡ・ ７．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｗｏｒｔｈｙ ｏｆ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｔｈａｔ ＭＤＡ一７ ｇｅｎｅ Ｃａｎ ｎｏｔ ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ，ｓｏｍｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＭＤＡ－７． Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｉｓ ｎｏｗ ｏｆ ａｗｉｄｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｔｈｏｕｇｈ ｉｔ ｉｓ ｍｏｒｅ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｏｔｈｅｒ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｓｉｎｃｅ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｈａｓ ｔｈｅ ｓｅｃｕｒｉｔｙ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｗｅ Ｃａｎ ａｃｈｉｅｖｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ’Ｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎｇ ｂｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｏｎｔｏ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｗｅ ｕｓｅ ａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ５（Ａｄ５）ｖｅｃｔｏｒ（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ －ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓ Ａｄ－ｍｄａ７ ａｎｄ ｅｍｐｔｙ ｖｉｒｕｓ Ａｄ－ＧＦＰ，ｕｓｉｎｇ ＨＥＫ ２９３Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ－ｍｅａｓｕｒｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ＦＡＣＳ ａｎａｌｙｓｉｓ
前言 前言 黑色素瘤分化相关基因７（ＭＤＡ．７，ｍｅｌａｎｏｍａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ－７） 是１９９５年由Ｊｉａｎｇ［１ｌ等利用差减杂交法从Ｄ干扰素（ＩＦＮ－ｐ）和瑞香素（ＭＥＺ） 诱导的终端分化的人黑色素瘤细胞ＨＯ．１的细胞ｅＤＮＡ文库中克隆到的基因，全 长ＭＤＡ．７的ｃＤＮＡ为１７１８ｂｐ，由７个外显子和６个内含子组成，主要开放阅 读框编码了一个包含２０６个氨基酸的２３．８ｋＤａ的多肽，存在一种可以被切割并分 泌的含有４９个氨基酸的信号肽。在脾、胸腺、外周血单核细胞等免疫器官中可 以检测到ＭＤＡ．７／ＩＬ－２４的表达，在早期黑色素肿瘤中也可以检测到ＭＤＡ．７的表 达，但是在恶性黑色素瘤和其他人类肿瘤细胞中却很少能检测到它的表达。后根 据ＭＤＡ．７的结构序列的同源性，染色体定位以及类细胞因子的特点，将其定义 为ＩＬ．１０家族中的新的一员：白介素２４（ＩＬ．２４，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２４）【ｚＪ，ＭＤＡ－７／ＩＬ一２４ 位于人类染色体的１ｑ３２．３３，这个１９５ｋｂ的基因组区表达包括ＩＬ．１０、ＩＬ．１９、ＩＬ．２０ 和ＩＬ．２４等ＩＬ．１０细胞因子家族１３Ｊ。 从ＨＯ．１的差减杂交的结果中，人们发现ＭＤＡ．７在细胞体外生长停滞和细 胞分化中明显上调，另一方面，随着黑色素瘤的恶性程度发展，相比于基础级的 黑色素细胞以及痣中，径向生长期（ｒａｄｉａｌ ｇｒｏｗｔｈｐｈａｓｅ）和垂直生长期（ｖｅｒｔｉｃａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）的黑色素瘤衍生细胞中ＭＤＡ．７的表达水平要明显降低【ｌＪ，而在垂 直生长期晚期和转移期黑色素瘤中，ｍＲＮＡ水平上的ＭＤＡ一７就已经基本检测不 到了【３１。后来的研究结果从来源于黑色素瘤衍生组织样品的蛋白水平表达结果 上，证实了这样的论断【４，５１，这样的结果都暗示了ＭＤＡ．７基因的肿瘤生长抑制作 用。事实上从大量的研究中人们发现，ＭＤＡ．７基因具有显著的肿瘤生长抑制和 凋亡诱导作用，而且这种凋亡诱导作用具有选择性：对相对应的正常细胞没有作 用［６】，除了直接诱导肿瘤细胞凋亡外，ＭＤＡ．７还具有加强放化疗敏感性１７Ｊ、抗血 管生成【８，９１以及免疫调节【２，１０】等作用，应用前景广泛。 ＭＤＡ．７编码的２４ｋＤａ蛋白氨基酸序列中包含有一个ＩＬ．１０家族的特征序列 （ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｍｏｔｉｆ从１０１ａａ至１２１ａａ），这是一个被其他ＩＬ．１０细胞因子家族共享 的特征氨基酸序列【１１．１２】。同样属于ＩＬ．１０家族，ＩＬ．１９、ＩＬ．２０和ＩＬ．２４表现出受 体复合物的普遍共享，这三者都可以通过与ＩＬ．２０ＲＩ／ＩＬ．２０Ｒ２的结合达到信号传 递的目的，而且ＩＬ．２０与ＩＬ．２４又可以共享ＩＬ．２２Ｒ１／ＩＬ．２０Ｒ２０３１不过虽然共享受 体，生物活性上只有ＩＬ．２４具有肿瘤特异性凋亡诱导作用，而这种作用是不依赖 于受体结合的【１４１。 免疫系统受到ＰＨＡ、ＬＰＳ、ＣＤ３抗体等刺激物的刺激，实现ＭＤＡ．７蛋白的 生理水平上的表达，蛋白与ＩＬ．２０受体和／或ＩＬ．２２受体的结合，引发ＪＡＫ／ＳＴＡＴ
前言 途径的激活，从而对细胞生长产生影响，比如诱导细胞侵润、细胞生长和分化的 控制等等【１３１５１６】，实现ＭＤＡ．７生理表达水平上的调控作用。而在非生理表达水平 上（通常指过表达水平，比如借助质粒或者腺病毒载体等），ＭＤＡ．７的针对肿瘤 细胞具有凋亡诱导作用，而且这种作用不依赖于ＩＬ家族受体。目前在各种细胞 系中没有发现受体ｍＲＮＡ的表达量与ＭＤＡ．７基因的凋亡诱导作用的相关性，认 为ＭＤＡ．７在非生理表达水平下与目前未知的受体或者非受体类介导因子结合， 以产生作用。一旦ＭＤＡ．７达到定位和本地化表达，可以激活凋亡前通路比如线】、内质网压力应答途径【２０’２１’２２１、ＭＡＲＫ＋ＰＫＲ途径【２３弘】、 ＧＡＤＤｓ［２５２６］途径等来最终达到肿瘤细胞的凋亡诱导效果（见图１１２７】）。 图１，ＭＤＡ．７在癌细胞中作用的相关信号通路，摘自Ｌｅｂｅｄｅｖａ等【２７ｌ 现有实验已证明ＭＤＡ．７对乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、恶性胶质 瘤以及直肠癌细胞等有明显的凋亡诱导作用，而对相对应的正常细胞系没有类似 作用，但针对其他一些癌症比如鼻咽癌的研究则较少：Ｊｉａｎｇ［２８１等用ｐＲＥＰ４载体 搭载ＭＤＡ．７基因转染鼻咽癌细胞ＨＯＮＥ．１，发现ＨｙｇＲ克隆与空载体转染组相比 有一定程度的减少，而后Ｅｒｉｃ［３１等用实验从Ｉｒ删Ａ水平上证实ＩＦＮ．ｐ和ＭＥＺ可
前言 以诱导ＨＯＮＥ．１细胞产生ＭＤＡ．７，但目前还没有直接的ＭＤＡ一７诱导鼻咽癌细 胞凋亡的报道。 鼻咽癌病人虽然见于五大洲的许多国家和地区，但世界大部分地区发病率较 低，一般在１／１０万以下。其发病率以中国的南方较高，如广东、广西、湖南等 省，特别是广东的中部和西部的肇庆、佛山和广州地区更高。肇庆的四会其发病 率男性为２５．１２／１０万，女性为１２．１１／１０万；中山市男性为２１．７３／１０万，女性为 ８．６６／１０万；香港男性为２４．３／１０万，女性为１０．２／１０万。就全国而言，鼻咽癌的 发病率由南到北逐渐降低，如最北方的发病率不高于２－－－－３／１０万。鼻咽癌有明显 种族差异，好发于黄种人（中国、印度尼西亚、马来西亚、泰国、越南、菲律宾）， 白种人少见，世界上有些地区鼻咽癌的发病率与移居的种族有关，国外报告鼻咽 癌也多数病例是华侨。 针对ＭＤＡ．７的癌特异性凋亡作用，目前已有Ｉ期临床实验［２９－３０］在几种癌细 胞治疗中（无鼻咽癌）证实：腺病毒介导的Ａｄ－ｍｄａ７（ＩＮＯＮ ２４１）的临床有效性以 及安全性。但也有些肿瘤细胞对ＭＤＡ．７的凋亡作用有抵抗性，需要借助其他方 法才能实现凋亡诱导效果，比如胰腺癌细胞【３１】和某些肺癌细胞【３引。 为了探索针对人鼻咽癌细胞ＣＮＥ应用ＭＤＡ．７基因抗肿瘤的可行性，本实验 利用腺病毒载体系统构建搭载ＭＤＡ．７基因的复制缺陷型病毒Ａｄ．ｍｄａ７以及空病 毒Ａｄ．ＧＦＰ，用于感染ＣＮＥ细胞，以探索ＭＤＡ．７基因的针对鼻咽癌细胞的凋亡 诱导作用。与其他比如慢病毒载体、逆转录病毒载体等常见病毒载体相比，腺病 毒载体系统：１）病毒粒子相对稳定，基因组重排频率低；２）安全性好，未发现 与人类肿瘤发生有关；３）腺病毒基因组大（３６ｋｂ），有大片段插入携带可能；４） 宿主细胞广泛，针对大多数细胞都有１００％的感染效率，包括分裂和不分裂细胞。 缺点是构建和包装的过程比较复杂，给实验增加了工作量和难度。本实验所采用 的腺病毒系统属于目前比较常见的第一代（缺失了Ｅｌ区和Ｅ３区）重组人５腺 病毒，由穿梭质粒ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶ，腺病毒骨架质粒ＡｄＥａｓｙ １，以及重组优化大 肠杆菌ＢＪ５１８３组成，由于腺病毒本身基因组比较大，不适合分子克隆操作，设 计的穿梭质粒ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶ上构建有ＧＦＰ荧光蛋白标记以及多克隆位点区域， 大小约ｌＯｋｂ，用于克隆搭载目的基因ＭＤＡ．７。ＡｄＥａｓｙｌ为人工修饰过的腺病毒 基因组，约３３ｋｂ，上面缺失了腺病毒基因组的Ｅｌ区和Ｅ３区，使得所生产的腺 病毒不能在９１１和２９３以外的细胞中自我扩增，保证了实验的剂量可控性和以及 生物安全性，但是又保留了病毒高效的感染能力以及搭载基因的蛋白表达能力。 我们将ＭＤＡ．７基因克隆到穿梭质粒ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶ上，并与腺病毒骨架质粒 ＡｄＥａｓｙ ｌ同源重组得到携带ＭＤＡ．７的重组腺病毒质粒（空病毒为不携带ＭＤＡ．７ 基因的ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶ与ＡｄＥａｓｙ ｌ同源重组），转染２９３Ｔ细胞中对其进行生产
扩增、滴度测定，并针对人鼻咽癌细胞ＣＮＥ ＭＤＡ．７基因针对鼻咽癌细胞的凋亡诱导效果 ＳＧＣ．７９０１进行了一系列感染和检测，作为参
一． 塑整塑查鎏 一—— 材料与方法 Ｉ材料 １．Ｉ菌株和质粒 １．１．１腺病毒载体系统。 购自美国Ｓｔｒａｔａｇｃｎｃ公司，包括： １）穿梭质粒ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶ Ｋａｎ抗性，携带ＧＦＰ标记，有多克隆位点区域和与ＡｄＥａｓｙｌ的同源 点图１，ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶ质粒图谱 ２）腺病毒骨架质粒ＡｄＥａｓｙ １Ａｍｐ抗 图２，ＡｄＥａｓｙ一１质粒图谱 位点
材料和方法 ３）重组优化大肠杆菌ＢＪ５ １８３ Ｓｔｒｅｐ抗性，转化效率低但是同源重组效率高，用于ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶ穿梭质 粒和ＡｄＥａｓｙｌ腺病毒骨架质粒的同源重组，需要用电转化将两质粒转入。 １．１：．２ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ。由本实验室保存，用于质粒扩增和常规转化 １．１．３ ｐＲＥＰ４质粒‘１１。载有ＭＤＡ一７基因，由美国哥伦比亚大学Ｐａｕｌ Ｂ．Ｆｉｓｈｅｒ 教授惠赠，常规培养下为Ａｍｐ抗性， ＭＤＡ．７片段位于ＫｐｎＩ－ＸｈｏＩ之间。 一一１．２ 酶、主要试剂和仪器 图３，ｐＲＥＰ４质粒图谱 １．２．１酶和主要购买试剂 限制性内切酶（ＫｐｎＩ，ＸｈｏＩ，ＰａｃＩ，ＰｍｅＩ）购于ＮＥＢ公司： Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶以及Ｔ４ ＤＮＡ连接酶购于上海Ｓａｎｇｏｎ公司； ＧｅｎＣｌｅａｎ琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程公司 超薄ＤＮＡ凝胶回收试剂盒购于Ｔｉａｎｇｅｎ公司； Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８凋亡染色试剂盒购于碧云天（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）公司； 细胞转染用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ。。Ｍ２０００购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；