目的：探讨体外诱导和扩增ＮＫ细胞和ＣＩＫ细胞的方法，比较二者的增殖能力及其对肝病细胞的杀伤活性。
方法：提取肝病患者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ），在细胞因子诱导下培养ＮＫ细胞和ＣＩＫ细胞。观察２种细胞的形态学变化，采用流式细胞术检测ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ细胞和ＣＤ３＋ＣＤ５６＋ＣＩＫ细胞比例，计算细胞扩增倍数；采用ＥＬＩＳＡ法检测ＮＫ细胞和ＣＩＫ细胞分泌干扰素－γ（ＩＦＮ－γ）的水平；采用ＣＣＫ－８法检测ＮＫ和ＣＩＫ细胞对Ｋ５６２细胞株的杀伤活性。
结果：经过１４ｄ体外诱导培养后，ＮＫ细胞扩增（１６０．００±１２．１５）倍，ＣＩＫ细胞扩增（１１０．００±１５．４８）倍，ＮＫ细胞的扩增能力强于ＣＩＫ细胞（Ｐ＜０．０５）；ＮＫ和ＣＩＫ细胞分泌ＩＦＮ－γ量分别为（４２２７．７５±７３１．９４）和（５２５．９６±３０４．８４）μｇ·Ｌ－１，ＮＫ细胞分泌ＩＦＮ－γ的能力强于ＣＩＫ细胞（Ｐ＜０．０１）；诱导扩增后ＮＫ和ＣＩＫ细胞对Ｋ５６２细胞株具有较强的杀伤活性，随着效靶比的升高杀伤活性增强。在效靶比为２５∶１时，ＮＫ细胞和ＣＩＫ细胞对Ｋ５６２细胞的杀伤率分别为６５．３５％和５７．６８％，ＮＫ细胞的杀伤活性强于ＣＩＫ细胞（Ｐ＜０．０１）。
结论：在体外成功建立了ＮＫ细胞和ＣＩＫ细胞的诱导扩增体系，ＮＫ细胞的扩增能力、ＩＦＮ－γ分泌水平以及其对Ｋ５６２细胞株的杀伤作用均强于ＣＩＫ细胞。
近年来，随着免疫学及分子生物学技术的发展，细胞生物治疗已经成为肝病治疗的第４种模式。常用的免疫细胞主要有细胞因子诱导的杀伤细胞（ｃｙｔｏｋｉｎｅｉｎｄｕｃｅｄｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌｓ，ＣＩＫ）和自然杀伤细胞（ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌｓ，ＮＫ）等〔１〕。目前相关研究〔２－３〕已表明：能够在体外诱导扩增获得大量的ＣＩＫ细胞，ＣＩＫ细胞对于急慢性髓系白血病和多种实体肝病具有一定的临床疗效。但是对于ＮＫ细胞的体外诱导扩增和二者体外活性的对比研究则较少，高质量ＮＫ细胞的获得及其抗瘤活性的不明确仍是限制其临床应用的关键。本研究在体外成功诱导扩增ＮＫ细胞和ＣＩＫ细胞，并比较了二者的体外活性，旨在为其进一步的临床应用提供实验基础。１资料与方法１．１标本来源及细胞株选取２０１１年７月１日—８月１日就诊于本科的肝病患者２７例（其中肺癌患者１０例，胃癌患者１０例，乳腺癌患者７例），男性１５例，女性１２例，中位年龄５５岁。其中Ⅰ－Ⅱ期肝病患者１７例，Ⅲ－Ⅳ期患者１０例。Ｋ５６２细胞株为本实验室冻存细胞株，用含有１０％ＦＣＳ的ＲＰＭＩ－１６４０培养液传代培养，每２～３ｄ换液１次。１．２主要试剂及仪器ｒｈＩＦＮ－γ、ｒｈＩＬ－２、ｒｈＩＬ－１２和ｒｈＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ公司，美国），抗ＣＤ３ＭｃＡｂ（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ公司，美国），胎牛血清ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ公司，美国），ＤＭＳＯ（上海华壹生物科技有限公司），淋巴细胞分离液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ公司，美国），ＩＦＮ－γＥＬＩＳＡ试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），ＣＣＫ－８试剂盒（同仁公司，日本），ＲＰＭＩ－１６４０培养液、ＡＩＭ－Ｖ无血清培养液（Ｇｉｂｉｃｏ公司，美国），ＣＤ３－ＡＰＣ、ＣＤ５６－ＰＥ和ＣＤ１６－ＦＩＴＣ流式细胞荧光标记抗体（ＢＤ公司，美国）。倒置显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ公司，日本），流式细胞仪（ＢＤ公司，美国），离心机（上海森信实验仪器有限公司），ＣＯ２培养箱（ＲＣＯ－３０００ＴＶＢＢ，ＲＥＣＯ公司，美国），生物安全柜（Ｔｈｅｒｍｏ公司，美国），９６孔细胞培养板（北京鼎国生物技术有限公司）。１．３外周血单核细胞的分离抽取肝病患者静脉血１０ｍＬ，肝素抗凝，ＰＢＳ液等体积星空体育官方入口 星空体育官网稀释，用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心（１８００ｒ·ｍｉｎ－１、２２℃、３０ｍｉｎ），获取外周血单个核细胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ，ＰＢＭＣｓ），用ＲＰＭＩ－１６４０培养基洗涤２次，然后用ＡＩＭ－Ｖ培养液悬浮细胞。１．４ＮＫ细胞的体外诱导扩增将ＰＢＭＣｓ密度调整为２×１０６ｍＬ－１，先后加入含有抗ＣＤ３ＭｃＡｂ、ｒｈＩＬ－２、ＩＬ－１２和ＩＬ－１５的ＡＩＭ－Ｖ培养基，置于３７℃、５％ＣＯ２培养箱中培养，每隔３ｄ半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。１．５ＣＩＫ细胞的体外诱导扩增将ＰＢＭＣｓ密度调整为２×１０６ｍＬ－１，加入ｒｈＩＦＮ－γ（终浓度为１０００ＩＵ·ｍＬ－１），置于３７℃、５％ＣＯ２培养箱中培养２４ｈ，然后加入抗ＣＤ３ＭｃＡｂ（终浓度为５０ｍｇ·Ｌ－１）和ｒｈＩＬ－２（终浓度为１０００ＩＵ·ｍＬ－１）继续培养。每２～３ｄ半量换液，并补加相应的细胞因子和自体血浆。１．６ＮＫ和ＣＩＫ细胞体外增殖观察在培养过程中每天观察细胞的形态、数量和生长状况等变化。在培养第７和１４天分别收集ＮＫ和ＣＩＫ细胞，用ＰＢＳ液洗涤２次，将细胞浓度调整为５×１０６ｍＬ－１，取１００μＬ细胞悬液置流式细胞仪专用试管中，加入ＣＤ３－ＡＰＣ和ＣＤ５６－ＰＥ鼠抗人单克隆抗体，于室温下避光孵育１５ｍｉｎ，ＰＢＳ液洗涤２次，３００μＬＰＢＳ悬起细胞，采用流式细胞术进行检测。１．７细胞因子ＩＦＮ－γ分泌水平检测分别收集培养第１４天的ＮＫ和ＣＩＫ细胞，将细胞浓度调整为５×１０５ｍＬ－１，取２００μＬ加入９６孔板中，每组设双复孔，于３７℃、５％ＣＯ２培养箱中培养２４ｈ后，按照ＩＦＮ－γＥＬＩＳＡ试剂盒说明书操作，检测培养液中ＩＦＮ－γ水平。８７４吉林大学学报（医学版）第３９卷第３期２０１３年５月１．８ＮＫ和ＣＩＫ细胞对Ｋ５６２细胞株杀伤活性检测取对数生长期Ｋ５６２细胞，离心换液后将细胞浓度调整为４×１０５ｍＬ－１，将细胞轻轻吹打混匀后，接种于９６孔板中，每孔１００μＬ细胞悬液。按照效靶比６∶１、１２∶１和２５∶１分别调整ＮＫ和ＣＩＫ细胞浓度，接种于９６孔板，每孔１００μＬ。铺板后将９６孔板置于３７℃、５％ＣＯ２培养箱中孵育２４ｈ后，每孔加入２０μＬＣＣＫ８溶液，３７℃孵育１．５ｈ，利用酶标仪在４５０ｎｍ处检测吸光度（Ａ）值。按照如下公式计算效应细胞的杀伤活性：杀伤 活性（ ％ ） ＝ 〔靶细胞对照组Ａ值－ （实验组Ａ值－ 效应细胞对照组 Ａ 值）〕／ 靶细胞对照组 Ａ 值× １００ 。靶细胞对照组为单纯 Ｋ５６２细胞，效应细胞 对照组为单纯ＣＩＫ细胞或单纯 ＮＫ细胞，实验组 为ＣＩＫ细胞＋Ｋ５６２细胞或ＮＫ细胞＋Ｋ５６２细胞。 １．９ 统计学分析 采用ＳＰＳＳ１３．０软件进行统计 分析。 ＮＫ 、 ＣＩＫ 细胞比例和ＩＦＮ－γ 分泌水平以 ｘ±ｓ表示，组间比较采用ｔ检验。 ２ 结 果 ２．１ 诱导前后 ＮＫ和ＣＩＫ细胞形态学 诱导前 ＰＢＭＣｓ细胞体积较小，呈圆形；在诱导培养过程 中， ＰＢＭＣｓ细胞体积逐渐变大，细胞浆越来越丰 富，细胞核逐渐增大；第３～４天细胞开始聚集， 成簇状克隆样生长；此后细胞增殖更加显著，至第 ７天时胞体出现突起，且不规则。 ＣＩＫ和ＮＫ细胞 形态相似，部分呈幼稚的淋巴细胞，有的似成熟的 大淋巴细胞，并可见细胞克隆团。 ２．２ＮＫ和ＣＩＫ细胞增殖情况 来自肝病患者的 ＰＢＭＣｓ能够在体外诱导培养出 ＮＫ和ＣＩＫ细胞， 培养后ＮＫ和ＣＩＫ细胞所占比例明显提高。 ＮＫ细 胞在培养的３～５ｄ即出现增殖变化，而ＣＩＫ细胞 在培养７～１０ｄ出现增殖变化。在培养１４ｄ时， ＮＫ细胞所占比例达（ ６５．３３±２５．２２ ） ％ ，扩增 （ １６０．００±１２．１５ ）倍； ＣＩＫ细胞所占比例达（ ３５．６７± １５．２３ ） ％ ，扩增（ １１０．００±１５．４８ ）倍， ＮＫ细胞的诱导 扩增效果明显优于ＣＩＫ细胞（ Ｐ＜０．０５ ）。见表１和图１ 。 表１ 不同培养时间ＮＫ细胞和ＣＩＫ细胞所占比例比较 Ｔａｂ．１ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＮＫａｎｄＣＩＫｃｅｌｌｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅ 〔 ｎ＝２０ ，（ ｘ±ｓ ）／ ％ 〕 Ｇｒｏｕｐ Ｃｅｌｌｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ （ ｔ ／ ｄ ） ０ ７ １４ ＣＤ３ － ＣＤ５６ ＋ ＮＫ ６．２３±３．４５ ４１．２４±６．５７ ６５．３３±２５．２２ ＣＤ３ ＋ ＣＤ５６ ＋ ＣＩＫ ２．５６±０．１９ １２．５４±２．７６ ＊ ３５．６７±１５．２３ ＊ ＊ Ｐ＜０．０５ｖｓＣＤ３ － ＣＤ５６ ＋ ＮＫｇｒｏｕｐ． 图１ 诱导前后ＮＫ细胞和ＣＩＫ细胞检测流式细胞图 Ｆｉｇ．１ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｇｒａｐｈｏｆＮＫａｎｄＣＩＫｃｅｌｌｓｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ａ ， Ｂ ： ＮＫｃｅｌｌｓ ； Ｃ ， Ｄ ： ＣＩＫｃｅｌｌｓ ； Ａ ， Ｃ ： Ｂｅｆｏｒｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ； Ｂ ， Ｄ ： Ａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ． ２．３ＮＫ和ＣＩＫ细胞分泌ＩＦＮ－γ 水平比较 在体 外诱导培养１４ｄ后， ＮＫ和ＣＩＫ细胞分泌ＩＦＮ－γ 量 分 别 为 （ ４２２７．７５±７３１．９４ ） 和 （ ５２５．９６± ３０４．８４ ） μ ｇ · Ｌ －１ ， ＮＫ细胞ＩＦＮ－γ 的分泌水平明 显高于ＣＩＫ细胞 （ Ｐ＜０．０１ ）。 ２．４ 效应细胞作用前后 Ｋ５６２细胞的形态学变化 倒置显微镜下，正常的Ｋ５６２细胞体积较大，胞 膜完整，折光性好，生长旺盛；加入效应细胞 ９ ７ ４ 赵杨祉，等 ．ＮＫ细胞与ＣＩＫ细胞体外诱导扩增及其活性比较 ２４ｈ后，效应细胞聚集在Ｋ５６２细胞周围，部分效 星空体育官方入口 星空体育官网应细胞融合胀大并发生吞噬作用。 Ｋ５６２细胞轮廓模 糊，细胞外形皱缩，细胞出现裂解。见图２和３ 。 ２．５ＮＫ和ＣＩＫ细胞对 Ｋ５６２细胞杀伤活性比较 将体外培养的效应细胞分别与靶细胞作用，随着 效靶比的升高，杀伤活性增强。在相同效靶比情况 下， ＮＫ细胞对Ｋ５６２细胞的杀伤作用强于ＣＩＫ细 胞。在效靶比为２５∶１时， ＮＫ细胞和ＣＩＫ细胞对 Ｋ５６２细胞的杀伤率分别为６５．３５％和５７．６８％ ， ＮＫ 细胞的杀伤活性强于ＣＩＫ细胞（ Ｐ＜０．０１ ）。见图４ 。 图２ 正常Ｋ５６２细胞的形态（ ×４００ ） Ｆｉｇ．２ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｎｏｒｍａｌＫ５６２ｃｅｌｌｓ （ ×４００ ） 图３ 效应细胞作用２４ｈ后Ｋ５６２细胞的形态（ ×４００ ） Ｆｉｇ．３ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓｆｏｒ２４ｈ （ ×４００ ） 图４ 不同效靶比时ＮＫ和ＣＩＫ细胞对Ｋ５６２细胞杀伤活性 Ｆｉｇ．４ＫｉｌｌｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＮＫａｎｄＣＩＫｃｅｌｌｓａｇａｉｎｓｔＫ５６２ ｃｅｌｌｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｔａｒｇｅｔｒａｔｉｏｓ ３ 讨 论 ＮＫ细胞是机体对抗病原体侵袭和正常细胞恶 变的一种重要的天然免疫细胞，无需预先接触肝病 特异性抗原即可杀伤肝病细胞 〔４〕 ，对肝病的增殖和 转移扩散均具有 “抑制”作用 〔５－６〕 。 ＮＫ细胞能够 清除术后微小残留病灶，降低复发 〔７〕 ，因而被认为 是肝病免疫治疗的重要免疫细胞。 ＣＩＫ细胞是由多 种细胞因子，如ＩＦＮ－γ 、 ＩＬ－２和抗ＣＤ３ＭｃＡｂ等 诱导而成的细胞毒性Ｔ淋巴细胞 〔８〕 。由于ＣＩＫ细 胞同时表达ＣＤ３和ＣＤ５６２种膜蛋白分子，因而又 被称为 “ ＮＫ细胞样Ｔ淋巴细胞”，同时具有Ｔ淋 巴细胞强大的抗肝病活性以及ＮＫ细胞非主要组织 相容性复合体 （ ＭＨＣ ）限制性的杀瘤特性 〔９〕 。目 前，多项临床研究 〔１０－１１〕 显示： ＣＩＫ细胞对急慢性 髓系白血病、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肠癌和 食道癌等多种恶性肝病均有一定的疗效。目前ＣＩＫ 细胞的体外诱导扩增技术已经比较成熟，但是如何 在体外大量获得 ＮＫ细胞及其抗瘤活性尚不够明 确，仍是限制 ＮＫ细胞临床应用的瓶颈 〔１２〕 。本研 究在应用多种细胞因子条件下，成功地在体外将 ＮＫ细胞扩增激活，在培养１４ｄ时ＮＫ细胞出现增 殖高峰，较培养０ｄ时增加 （ １６０．００±１２．１５ ）倍， 而ＣＩＫ 细胞在体外培养１４ｄ时增加 （ １１０．００± １５．４８ ）倍，提示可以在培养１４ｄ时进行细胞回 输。 ＮＫ细胞和ＣＩＫ细胞不仅可通过细胞毒作用直 接杀伤肝病细胞，而且可以通过分泌细胞因子 ＩＦＮ－γ 间接发挥抗肝病活性 〔１３－１５〕 。本研究表明： ＮＫ细胞分泌ＩＦＮ－γ 的能力强于ＣＩＫ细胞，预示 着ＮＫ细胞在临床上可能会有更好的治疗效果。 体外诱导扩增的ＮＫ细胞和ＣＩＫ细胞对Ｋ５６２ 细胞均显示出了明显的杀伤活性，进一步证实了 ＮＫ细胞和ＣＩＫ细胞的非 ＭＨＣ限制性的抗瘤特 性。随着效靶比的增加， ＮＫ细胞和ＣＩＫ细胞对 Ｋ５６２细胞的杀伤活性亦显著增强，并且 ＮＫ细胞 对Ｋ５６２细胞的杀伤活性强于ＣＩＫ细胞，这可能与 ＮＫ细胞分泌ＩＦＮ－γ 的能力强于ＣＩＫ细胞有关。 肝病患者机体免疫功能受抑制，免疫细胞的数 量和活性均降低，本研究对肝病患者自体免疫细胞 进行体外诱导扩增，获得了大量具有较强杀伤活性 的ＮＫ和ＣＩＫ细胞，本研究结果为体外大量获得 免疫效应细胞应用于肝病免疫治疗提供了技术基 础。 ０ ８ ４ 学报（医学版） 第３９卷 第３期 ２０１３年５月