(1)培养瓶的包被：向培养瓶中加入抗体包被液，于4℃静止过夜，随后弃去抗体包被
液，用PBS缓冲液冲洗2～3遍，加入10mL的PBS缓冲液，置于4℃保存，备用；
(2)外周血单个核细胞的准备：使用含有肝素钠的采血管采集患者外周血，离心分离得
到血浆，加等体积生理盐水重悬细胞；用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，随后用
使用T细胞扩增培养基重悬外周血单个核细胞，重悬后细胞悬液总体积不超过50mL；将
cells/mL；培养第7天或细胞体积到达450～550mL后，转入细胞培养
所述T细胞扩增培养基中，含有1％(v/v)的自体血浆、终浓度10ng/mL的IL7、终浓度
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述抗体包被液为pH值8.0的PBS缓冲
液，其中含有5μg/mL抗CD3活化性抗体和5μg/mL抗CD28活化性抗体。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述T细胞扩增培养基中，含有1％(v/v)
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述自体血浆是通过以下方法得到的：
收集患者自体血浆，于56℃孵育30min，随后4℃静止1小时，使用4000×g离心力离心20min，
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)T细胞扩增培养基重悬外周血单
近年来，过继性免疫细胞治疗特别是嵌合型抗原受体细胞(Chimeric antigen
为研究的热点。研究发现，过继T细胞在体内的生存和扩增能力与治疗效果高度相关，T细胞
在体内的生存和扩增能力又与T细胞的分化程度呈负相关，T细胞分化程度越高其在体内增
然而，虽然已有多种T细胞体外扩增方法，但这些T细胞扩增方法，往往会导致T细
胞终末分化为效应T细胞，回输患者体内后细胞增殖和扩增能力低下，严重影响过继性T细
胞治疗的疗效。因此，开发一种能够减少T细胞终末分化的新型快速扩增方法，使T细胞分化
，保持T细胞在体内的生存能力，提高T细胞治疗的效果，具有重要的临床应用意义。
(1)培养瓶的包被：向培养瓶中加入抗体包被液，于4℃静止过夜，随后弃去抗体包
被液，用PBS缓冲液冲洗2～3遍，加入10mL的PBS缓冲液，置于4℃保存，备用；
(2)外周血单个核细胞的准备：使用含有肝素钠的采血管采集患者外周血，离心分
离得到血浆，加等体积生理盐水重悬细胞；用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，随后
50mL；将细胞悬液加入步骤(1)包被后的培养瓶中，置于37℃、5％(v/v)CO
所述T细胞扩增培养基中，含有1％(v/v)的自体血浆、终浓度10ng/mL的IL7、终浓
所述抗体包被液为pH值8.0的PBS缓冲液，其中含有5μg/mL抗CD3活化性抗体和5μ
所述T细胞扩增培养基中，含有1％(v/v)的自体血浆、终浓度10ng/mL的IL7、终浓
所述自体血浆是通过以下方法得到的：收集患者自体血浆，于56℃孵育30min，随
后4℃静止1小时，使用4000×g离心力离心20min，去除杂质，置于4℃保存，备用。
(Nicotinamide，NAM)扩增获得T细胞，通过研究不同浓度的NAM对扩增的T细胞中T
胞扩增倍数和细胞抗凋亡能力的影响，得到扩增培养基中加入10mM NAM是扩增T细胞的最
佳剂量。结果表明：培养基中含10mM NAM时扩增T细胞，不仅不会减少T细胞的总数，而且会
通过培养基中添加NAM扩增获得的T细胞，对CD3活化性抗体再刺激反应能力研究
表明，T细胞不仅具有更强的抗凋亡能力，还具有更强的增殖和细胞因子表达潜力。
本发明方法将NAM添加到T细胞扩增培养物中，可获得更多中央记忆性T细胞，显著
提高T细胞的质量。这种新颖的策略可以有效保持T细胞的“年轻”状态，为T细胞的临床治疗
应用提供良好基础。可以预见，当过继输注给患者时，会增强它们的抗肿瘤作用。因此，本发
图1为对比不同浓度NAM培养基扩增的T细胞流式检测中央记忆性T细胞表面标志
图4为不同浓度NAM培养基中培养的T细胞抗凋亡分子Bcl2和凋亡相关分子Fas基
图5为NAM培养的T细胞再次活化后流式检测中央记忆性T细胞表面标志CD45RO和
其中，a图为典型的流式散点图，b图为流式结果统计图，NAM(‑)为无NAM培养基组，
其中，数据处理以无NAM培养基中培养细胞不使用anti‑CD3再刺激的细胞吸光度
为1，计算不同处理后细胞增殖倍数，数据呈现使用Mean±SD，***为P＜0.001。
图7为NAM培养的T细胞再刺激后定量PCR检测抗凋亡分子Bcl‑2和细胞因子的基因
其中，a图为Bcl‑2基因表达统计图，b图为细胞因子基因表达统计图，数据处理以
无NAM培养的细胞基因表达为1，计算NAM培养基组基因表达变化倍数，数据呈现使用Mean±
施例中所涉及的仪器设备均为常规仪器设备；涉及试剂均为市售常规试剂；涉及试验方法
(1)培养瓶的包被：向T75培养瓶中加入8mL抗体包被液，于4℃静止过夜，随后星空体育官方入口 星空体育官网弃去
抗体包被液，用PBS缓冲液冲洗3遍，加入10mL PBS缓冲液，置于4℃保存，备用；
其中，抗体包被液为：pH值8.0的PBS缓冲液中，含有5μg/mL抗CD3活化性抗体和5μ
(2)外周血单个核细胞的准备：使用含有肝素钠的采血管采集患者外周血50mL，
700×g离心10min分离血浆；使用等体积的生理盐水重悬细胞，用淋巴细胞分离液分离外周
(3)自体血浆的处理：收集患者自体血浆，56℃孵育30min，随后4℃静止1h，使用
使用T细胞扩增培养基重悬外周血单个核细胞，重悬后细胞悬液调整细胞密度为1
其中，采用的T细胞扩增培养基为GT‑T551‑H3无血清培养基，含有1％的(v/v)自体
将细胞悬液加入步骤(1)包被后的培养瓶中，置于37℃、5％(v/v)CO
可补加T细胞扩增培养基)；培养第7天或细胞体积到达450～550mL后，转入细胞培养袋，继
采用实施例1的方法扩增T细胞，研究不同NAM添加量对T细胞扩增效果的影响。通
过改变步骤(4)T细胞扩增培养基中NAM的添加量，分别设置不同NAM添加量的组别：不添加
收集待测样品，通过500×g离心获得细胞。用PBS洗涤2次后，将收获的细胞分别使
结果分析，首先将CD3阳性细胞圈群，标记为T细胞，然后在T细胞群中分析CD45RO
细胞占T细胞群的百分比。如图1所示，与0mM NAM组相比，含有5mM、10mM或
以上结果表明，使用含10mM和20mM的NAM组能显著提高扩增的T细胞中T
T细胞，通常需要将T细胞扩增至少100倍左右。因此，为进一步评价添加NAM扩增获得的T细
胞是否能够满足临床实际需求，我们评价了不同浓度的NAM在14天中T细胞扩增倍数，如图3
和10mM NAM组。这些结果表明，使用5mM和10mM的NAM扩增T细胞，可以获得满足临床治疗需
T细胞活化过程中，线粒体生物合成和呼吸作用会显著增加，以提供足够的ATP用
于细胞生长期间的增殖和分化。线粒体呼吸增加会导致线粒体产生活性氧(ROS)的快速增
加，高水平的ROS通过激活诱导的细胞死亡(AICD)或激活的细胞自主死亡(ACAD)来驱动T细
胞凋亡。AICD机制主要由Fas/Fas‑L通路介导。ACAD机制主要依赖于内在死亡途径，它涉及
Bcl‑2家族蛋白的促凋亡和抗凋亡成员。NAM先前已被证明可降低ROS水平，并抑制多种类型
细胞中ROS诱导的细胞凋亡并上调Bcl‑2表达。因此，通过qPCR检测促凋亡(Fas)和抗凋亡
mRNA特异性引物见表1。靶基因表达水平通过2ΔΔCT方法计算，用于对GAPDH表达进行归一
如图4所示，使用5mM、10mM和20mM NAM扩增的细胞，细胞中Bcl‑2基因表达水平相
对于0mM NAM组显著升高(图4a)。同时，在含有10mM或20mM NAM的培养基中培养的T细胞中，
Fas基因表达水平显著下降(图4b)。5mM NAM组的细胞中，Fas基因表达水平相对于0mM NAM
组在统计学上无显著差异。以上结果表明，在使用10mM或20mM NAM扩增的T细胞具有更强的
过继性T细胞的肿瘤治疗效果取决于回输T细胞在体内的免疫反应能力、增殖能力
和持久性。检测扩增后的T细胞对二次活化刺激的免疫反应能力、增殖能力和抗凋亡能力是
评价细胞质量的重要指标。为了进一步评价使用NAM中央记忆性T细胞扩增技术是否能提高
细胞在体内的增殖能力、免疫反应能力和抗凋亡能力，我们采用实施例1的方法扩增T细胞，
改变步骤(4)T细胞扩增培养基中NAM的添加量，分别设置不添加NAM处理组(NAM(‑)组)、添
加10mM的NAM处理组(NAM(+)组)。细胞扩增14天后，收集细胞进行以下实验。
扩增结束后，使用离心法分别收集NAM(+)组和NAM(‑)组细胞2×10
25min，离心弃去抗体，PBS洗两遍，随后进行流式检测。结果分析，首先圈定CD3阳性细胞群
为T细胞亚群，然后分析T细胞中CD45RO阳性的记忆性T细胞和CD45RO
结果显示，如图5所示，NAM(+)组使用CD3抗体再次刺激活化后，细胞中CD45RO
培养1小时。使用酶标仪测定OD450吸光度，数据处理以NAM(‑)组吸光度为1，计算其它组
结果显示，如图6所示，使用NAM(+)组扩增获得的T细胞在接受CD3抗体二次刺激活
化后，其细胞增殖能力显著高于NAM(‑)组。NAM(+)组在无CD3抗体刺激时，其细胞增殖能力
与NAM(‑)+anti‑CD3组相同。以上结果说明使用NAM扩增T细胞能显著提高T细胞二次活化后
扩增结束后，使用离心法分别收集NAM(+)组和NAM(‑)组细胞5×10
PCR系统中扩增分析。靶基因mRNA特异性引物见表1。靶基因表达水平通过2ΔΔCT方法计
结果表明，如图7a所示，使用NAM(+)组在CD3抗体活化后，其抗凋亡分子Bcl‑2基因
表达水平显著高于NAM(‑)组，说明NAM培养获得的T细胞在二次活化后仍具有更强的抗凋亡
能力。在细胞因子表达检测中我们发现，NAM(+)组不仅上调具有免疫活化作用的细胞因子
以上结果表明，使用NAM扩增获得的T细胞不仅具有更强的抗凋亡能力，而且还具