CCK8检测细胞增殖/毒性原理、方法及注意事项 一、CCK8检测细胞增殖/毒性原理 Cell Counting Kit-8（简称 CCK-8）试剂可用于简便而正确细胞增殖和毒性分析。其基础原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）作用下被细胞中脱氢酶还原为含有高度水溶性黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成甲瓒物数量和活细胞数量成正比。所以可利用这一特征直接进行细胞增殖和毒性分析。 用途：药品筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验 CCK8优点： 使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； CCK-8法能快速检测； CCK-8法检测灵敏度很高，甚至能够测定较低细胞密度； CCK-8法反复性优于MTT 法； CCK-8法对细胞毒性小； CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。 CCK8缺点： 和MTT法相 比，CCK8和XTT价格比较贵。 CCK8试剂颜色为淡红色，和含酚红培养基颜色靠近，不注意话轻易产生漏加或多加。 和以往增殖/毒性测定试剂相比较： 检测方法 MTT法 XTT法 WST-1法 CCK8法 甲臢产物水溶性 差（需加有机溶剂溶解） 好 好 好 产品性状 粉末 2瓶溶液 溶液 1瓶溶液 使用方法 配成溶液后使用 现配现用 即开即用 即开即用 检测灵敏度 高 很高 很高 高 检测时间 较长 较短 较短 最短 检测波长 560-600nm 420-480nm 420-480nm 430-490nm 细胞毒性 高，细胞形态完全消失 很低，细胞形态不变 很低，细胞形态不变 很低，细胞形态不变 试剂稳定性 通常 较差 通常 很好 批量样品检测 能够 很适合 很适合 很适合 便捷程度 通常 便捷 便捷 很便捷 二、CCK8检测细胞增殖/毒性方法 试验一：细胞增殖分析 1、制备细胞悬液：细胞计数 2、接种到96孔板中：依据适宜铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，一样样本可做3个反复。 3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，假如不需要贴壁，这步能够省去。 4、加入10ul CCK8：因为每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，提议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或直接配置含10%CCK8培养基，以换液形式加入。 5、培养1-4小时:细胞种类不一样，形成Formazan量也不一样。假如显色不够话，能够继续培养，以确定最好条件。尤其是血液细胞形成Formazan极少，需要较长显色时间（5-6小时）。 6、测定450nm吸光度：提议采取双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。 试验二：细胞毒性分析 1、制备细胞悬液：细胞计数 2、接种到96孔板中：依据适宜铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，一样样本可做3个反复。 3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，假如不需要贴壁，这步能够省去。 4、加入不一样浓度毒性物质 5、37℃培养箱中培养：加入毒性物质培养时间，要看毒性物质性质和细胞敏感性，通常要依据细胞周期来决定，起码要一代以上时间。 6、加入10ul CCK8：因为每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，提议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。 7、培养1-4小时:细胞种类不一样，形成Formazan量也不一样。假如显色不够话，能够继续培养，以确定最好条件。尤其是血液细胞形成Formazan极少，需要较长显色时间（5-6小时）。 8、测定450nm吸光度：提议采取双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。 注： 若临时不测定OD值，能够向每孔中加入10 μL星空体育网站 星空体育首页 0.1MHCL溶液或1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保留在室温条件下。二十四小时内测定，吸光度不会发生改变。 假如待测物质有氧化性或还原性线之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新培养基），去掉药品影响。当然药品影响比较小情况下，能够不更换培养基，直接扣除培养基中加入药品后空白吸收即可。 三、CCK8检测细胞增殖/毒性注意事项 当使用标准96孔板时，贴壁细胞最小接种量最少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时灵敏度相对较低，所以推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。 酚红和血清对CCK8法检测不会造成干扰，能够经过扣除空白孔中本底吸光度而消去。 CCK8能够检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖试验每次测定过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。 CCK-8在0-5℃下能够保留最少6个月，在-20℃下避光能够保留1年。 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈孔最轻易干燥挥发，因为体积不正确而增加误差。通常情况下，最外一圈孔只加培养基，不作为测定孔用。 在培养基中加入CCK8，培养一定时间，测定45
新高考生物二轮复习讲练测第6讲 遗传的分子基础（检测） （原卷版）.docx
新高考生物二轮复习讲练测第12讲 生物与环境（检测）（原卷版）.docx
新高考生物二轮复习讲练测第3讲 酶和ATP（检测）（原卷版）.docx
新高考生物二轮复习讲练测第9讲 神经调节与体液调节（检测）（原卷版）.docx
新高考生物二轮复习讲练测第11讲 植物生命活动的调节（讲练）（原卷版）.docx
新高考生物二轮复习讲练测第8讲 生物的变异、育种与进化（检测）（原卷版）.docx
新高考生物二轮复习讲练测第5讲 细胞的分裂、分化、衰老和死亡（讲练）（原卷版）.docx
新高考生物二轮复习讲练测第5讲 细胞的分裂、分化、衰老和死亡（检测）（原卷版）.docx
新高考生物二轮复习讲练测第12讲 生物与环境（讲练）（原卷版）.docx
新高考生物二轮复习讲练测第11讲 植物生命活动的调节（检测）（原卷版）.docx
东风风神全新一代E70汽车使用手册用户操作图解驾驶车主车辆说明书pdf电子版下载.pdf
2024《大股东减持的动因及后果研究案例—以汇顶科技公司为例》15000字.docx
原创力文档创建于2008年，本站为文档C2C交易模式，即用户上传的文档直接分享给其他用户（可下载、阅读），本站只是中间服务平台，本站所有文档下载所得的收益归上传人所有。原创力文档是网络服务平台方，若您的权利被侵害，请发链接和相关诉求至 电线) ，上传者