本发明涉及一种T细胞无血清培养基及其应用,所述T细胞无血清培养基由基础培养基和添加成分混合配制而成,所述添加成分由重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、重组人血清白蛋白、胸腺嘧啶、牛磺酸和亚叶酸组成,所述基础培养基是IMDM、DMEM、DMEM/F12、aMEM、RPMI1640、M199中的一种或几种的混合。本发明的培养基不仅化学成分明确,无血清,无人源和动物源成分,而且加入的成分种类更少,简化了配方,性能优异,T细胞培养10至12天可扩增400倍至1000倍,终末细胞活率可达85,‑95,。
1.一种T细胞无血清培养基,其特征在于,所述T细胞无血清培养基由基础培养基和添加成分混合配制而成,所述添加成分由重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、重组人血清白蛋白、胸腺嘧啶、牛磺酸和亚叶酸组成,每升所述T细胞无血清培养基中,所述重组人胰岛素为
2.根据权利要求1所述的T细胞无血清培养基,其特征在于,所述基础培养基是IMDM、DMEM、DMEM/F12、aMEM、RPMI1640、M199中的一种或几种的混合。
3.根据权利要求2所述的T细胞无血清培养基,其特征在于,所述基础培养基是IMDM、DMEM/F12和RPMI1640三种培养基的混合。
4.根据权利要求3所述的T细胞无血清培养基,其特征在于,所述IMDM、DMEM/F12和RPMI1640三种培养基的体积比为1:1:1。
5.根据权利要求2所述的T细胞无血清培养基,其特征在于,所述基础培养基是IMDM和RPMI1640两种培养基的混合。
6.根据权利要求5所述的T细胞无血清培养基,其特征在于,所述IMDM和RPMI1640两种培养基的体积比为1:1。
[0001]本发明涉及细胞培养技术领域,具体地说,涉及一种T细胞无血清培养基及其应用。
[0002]T细胞是淋巴细胞的主要组分之一,它具有多种生物学功能,如直接杀伤靶细胞,辅助其它淋巴细胞发挥功能,对特异性抗原或促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子,是身体抵御疾病感染、防止肿瘤形成的主要免疫细胞之一。在体外富集、活化、扩增这类免疫细胞,可用于回输治疗多种疾病,包括恶性肿瘤、感染、自身免疫病等。在这个过程中,使用安全可靠、化学成分明确的培养基对T细胞进行扩增,避免可能的人源、动物源病原体的引入风险,同时避免T细胞扩增体系汇总不明成分可能引起的机体免疫反应,对后续T细胞治疗产品的临床应用非常关键。
[0003]传统的T细胞培养基包含一定比例的血清。这种培养基的问题在于,1)血清批次间差异导致T细胞扩增效果不稳定,2)含异种动物(一般为牛)来源的血清成分,存在引入异种动物病原体感染的风险,增加了临床使用的风险,3)血清成分复杂,其中含有多种蛋白、生长因子等,其中有些成分会导致T细胞的过度激活和耗竭,不能达到最佳的T细胞扩增效果,
4)培养体系中异种动物源成分的可能残留,增加了细胞治疗产品质量控制和临床申报的困难。
[0004]现有的商业化T细胞无血清培养基存在以下问题,1)配方成分复杂,除基础培养基外,需添加至少十几种其它成分,2)大部分需添加人血清来源的人源白蛋白,增加了成分的复杂程度、原料来源的不稳定性及生产制造的难度,不能做到真正的化学成分明确,临床使用具有很大的不确定性。
[0005]专利文献CN108642006A,公开日2018.10.12,公开了一种T细胞无血清培养基及其使用方法,所述T细胞无血清培养基包括用于细胞生长培养的基础培养基,以及其他添加成分,所述其他添加成分包括乙醇胺、硫酸酮、硝酸铁、硫酸锌、亚硒酸钠、丙酮酸钠、胰岛素、转铁蛋白、谷氨酰胺、血清白蛋白、硫代甘油和L‑维生素C。取得的有益效果在于,在开发的整个培养基体系中没有引入非人源性蛋白,可对来源安全可靠的血液样本中的T细胞进行选择性地高效扩增。
[0006]上述专利文献公开的T细胞培养基,血清白蛋白使用的是酵母表达生产的重组人血清白蛋白,转铁蛋白使用的是酵母表达生产的重组人转铁蛋白,人胰岛素是使用酵母为载体生产出来的药用级的胰岛素,因而避免了培养基混入人源成分或其他动物来源成分。但仍然存在添加成分种类较多的缺陷,扩增效率稍显不足,细胞质量有待提高。因此有必要提供成分更简单,扩增效率高,培养的细胞质量更高的无血清及无人源、无动物源成分的T细胞培养基。
[0007]本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一种成分更简单,扩增效率高,培养的细胞质量更高的无血清及无人源、无动物源成分的T细胞培养基。
[0008]本发明的再一的目的是,提供所述T细胞无血清培养基的制备方法。
[0011]一种T细胞无血清培养基,所述T细胞无血清培养基由基础培养基和添加成分混合配制而成,所述添加成分由重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、重组人血星空体育登录入口 星空体育在线官网清白蛋白、胸腺嘧啶、牛磺酸和亚叶酸组成。
[0012]作为本发明的一种优选实施方案,每升所述T细胞无血清培养基中,所述重组人胰岛素为2.5‑50mg,所述重组人转铁蛋白为5‑100mg,所述重组人血清白蛋白为0.2‑5g,所述胸腺嘧啶为0.2‑20mg,牛磺酸为0.1‑10mg,所述亚叶酸为0.5‑50mg。
[0014]作为其中的一个优选例,所述基础培养基是IMDM、DMEM/F12和RPMI 1640三种培养基的混合。
[0016] 作为其中的另一个优选例,所述基础培养基是IMDM和RPMI1640两种培养基的混合。
[0023] 1、本发明的T细胞培养基化学成分明确,无血清,无人源和动物源成分,添加的人胰岛素、人转铁蛋白、人血清白蛋白均为重组表达产品,和传统的含血清及成分不明确的T 细胞培养基相比,具有更高的科研和临床应用价值。
[0024] 2、本发明的T细胞培养基通过配方的优化,去除传统配方中互相冲突的成分,简化了配方,添加成分种类更少,在科研和可能的临床应用中具有更高的稳定性和确定性。
[0025] 3、本发明的T细胞培养基性能优异,T细胞培养10至12天可扩增400倍至1000倍,终末细胞活率可达85,‑95,。
[0026] 图1 ,对应实施例1 ,为本发明所述T细胞无血清培养基中激活扩增的PBMC中T细胞增殖曲线。其中A为商品化的T细胞无血清培养基,B为本发明所述T细胞无血清培养基。
[0027] 图2,对应实施例1 ,为本发明所述T细胞无血清培养基中激活扩增的PBMC中T细胞增殖过程中的细胞活率数据。其中A为商品化的T细胞无血清培养基,B为本发明所述T细胞无血清培养基。
[0028] 图3,对应实施例2,为本发明所述T细胞无血清培养基中激活扩增的PBMC中T细胞增殖曲线。其中A为商品化的T细胞无血清培养基,B为本发明所述T细胞无血清培养基。
[0029] 图4,对应实施例2,为本发明所述T细胞无血清培养基中激活扩增的PBMC中T细胞增殖过程中的细胞活率数据。其中A为商品化的T细胞无血清培养基,B为本发明所述T细胞无血清培养基。
[0034] 实施例中其他所用的方法和试剂,除非另有说明,否则为本领域常规的方法和试剂。
[0035] 实施例1人外周血单核细胞(PBMC)中T细胞的激活扩增(一)
[0036] 本实施例中,使用IMDM、DMEM/F12和RPMI 1640三种培养基按体积比1 : 1 : 1混合配制成基础培养基,然后向其中添加终浓度为2.5g/L的重组人胰岛素,5mg/L的重组人转铁蛋白,0.2g/L的重组人血清白蛋白,0.2mg/L的胸腺嘧啶、0.2mg/L的牛磺酸、1mg/L的亚叶酸。由上述方法配制的T细胞无血清培养基用于后续T细胞激活扩增实验。
[0037] 使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC用于T细胞的激活扩增。将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中,接种密度1x106/ml,添加终浓度10μg/mL的CD3抗体,终浓度5μg/mL的CD28抗体,及终浓度100IU/mL的IL2,并放入37℃(5)二氧化碳培养箱内继续培养。分别于培养的第0天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天观察细胞增殖情况并对细胞进行计数,获得细胞增殖曲线和细胞活率的数据。细胞增殖曲线倍,活率达到87,。
[0038] 实施例2,人外周血单核细胞(PBMC)中T细胞的激活扩增(二)
[0039] 本实施例中,使用IMDM和RPMI 1640两种培养基按体积比1 : 1混合配制成基础培养基,然后向其中添加终浓度为5g/L的重组人胰岛素,20mg/L的重组人转铁蛋白,1g/L的重组人血清白蛋白,1mg/L的胸腺嘧啶、1mg/L的牛磺酸、10mg/L的亚叶酸。由上述方法配制的T细胞无血清培养基用于后续T细胞激活扩增实验。
[0040] 使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC用于T细胞的激活扩增。将分离好的PBMC细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中,接种密度1x106/ml,添加终浓度10μg/mL的CD3抗体,终浓度5μg/mL的CD28抗体,及终浓度100IU/mL的IL2,并放入37℃(5)二氧化碳培养箱内继续培养。分别于培养的第0天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天观察细胞增殖情况并对细胞进行计数,获得细胞增殖曲线和细胞活率星空体育登录入口 星空体育在线官网的数据。细胞增殖曲线倍,活率达到
[0044] 使用IMDM和RPMI 1640两种培养基按体积比1 : 1混合配制成基础培养基,然后向其中添加终浓度为5g/L的重组人胰岛素,20mg/L的重组人转铁蛋白, 1g/L的重组人血清白蛋白,1mg/L的胸腺嘧啶、1mg/L的牛磺酸、10mg/L的亚叶酸。
[0050] 使用IMDM和RPMI 1640两种培养基按体积比1 : 1混合配制成基础培养基,然后向其中添加终浓度为20g/L的重组人胰岛素,50mg/L的重组人转铁蛋白,5g/L的重组人血清白蛋白,10mg/L的胸腺嘧啶、0. 1mg/L的牛磺酸、0.5mg/L的亚叶酸。
[0052] 使用IMDM、aMEM和M199三种培养基按体积比1 : 1 : 1混合配制成基础培养基,然后向其中添加终浓度为50g/L的重组人胰岛素, 100mg/L的重组人转铁蛋白,4.5g/L的重组人血清白蛋白,20mg/L的胸腺嘧啶、5mg/L的牛磺酸、40mg/L的亚叶酸。
[0053] 以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。