在染料法荧光定量PCR实验中，熔解曲线发挥着关键作用，它可以帮助我们判断反应体系中是否存在非特异扩增。小编今天跟大家分享熔解曲线的原理、不同荧光定量仪器的熔解曲线设置方法和熔解曲线峰型不好的原因及解决办法。
在了解熔解曲线原理之前我们先回顾一下染料法荧光标记的作用原理。染料法荧光定量PCR实验中应用最广泛的染料是SYBR Green I，它可以广泛地结合到DNA双链的小沟中，发出比游离SYBR Green I强上千倍的荧光。因此，荧光信号的强度可以反映体系中双链产物量的变化，在整体反应过程中，荧光信号的变化可以描述产物积累的过程。
那么熔解曲线是如何产生的呢？随着PCR的进行，双链产物的不断增加，嵌入到双链中的荧光分子也不断增多，荧光信号逐渐增强。在扩增结束后，体系内的双链产物最多，荧光信号强度达到一个最高值。之后我们设置一段由65℃逐渐升温到95℃的程序，随着温度逐渐升高，DNA双链逐渐解链为单链，嵌入到双链中的荧光染料分子也会逐渐脱落下来，荧光信号强度逐渐下降。在某段温度时，双链迅速而大量地解链，荧光信号强度骤然下降，在这段温度中，一半的双链解链的温度我们称为熔解温度（即Tm值）。最终，DNA双链完全解链为单链，荧光值下降为一个本底水平。这一整体过程中的荧光信号随温度变化的曲线就是熔解曲线，称为原始图谱。该图谱做负导数换算后得到熔解曲线的导数图谱，导数图谱会出现熔解峰，熔解峰对应的温度就是Tm值。
不同的产物按照其GC含量，片段星空体育 星空体育平台大小，盐离子浓度的不同，其对应的Tm值也是不同的。所以，不同的产物在导数图谱中表现为不同位置的熔解峰。通过观察熔解曲线的形态，就可以判断PCR反应是否只扩增出了单一产物，是否有非特异结果出现。
以上我们了解了熔解曲线的原理之后，也就知道了熔解曲线℃组成。一般荧光定量仪器有默认的熔解曲线步骤，我们只需要在PCR反应程序后点击添加Melt curve即可。以下是几款常用荧光定量仪器染料法PCR扩增时熔解曲线的添加方法。
如果熔解曲线峰型不是单一尖锐的峰，产生了非特异峰，可能的原因及排除方法有：
●采用高灵敏的抗体修饰聚合酶和独特buffer组配，能够得到高特异性、高灵敏度的优质定量结果。
●Buffer中的H-Competitor因子和EP 组分，保证各种模板包括复杂高级结构、PCR 抑制剂残留较多以及长片段等模板都有非常特异的扩增。
各品牌试剂以人细胞cDNA为模板检测MIF基因的GC含量73%的片段，FP209熔解曲线峰型表现最好。