本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种淋巴细胞的扩增体系及扩增方法。该扩增体系包括组分1和组分2；组分1包括灭活的基因工程细胞1、胎牛血清IL‑2和淋巴细胞基础培养基；组分2为含灭活的基因工程细胞2的淋巴细胞基础培养基；基因工程细胞1为表达CD80、IL21、IL12的滋养细胞；基因工程细胞2为表达CD80、IL12的滋养细胞。本发明利用该扩增体系与NK细胞共培养，14天获得的NK细胞的存活率达92％，NK细胞扩增倍数约5000倍，达到各种临床适合治疗病症预期疗效应用要求；同时可以有效降低NK
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 112553157 A (43)申请公布日 2021.03.26 (21)申请号 3.4 (22)申请日 2020.12.23 (71)申请人 杭州中赢生物医疗科技有限公司 地址 310052 浙江省杭州市滨江区西兴街 道楚天路88号2号楼203室 (72)发明人 王冶陶彭昉俞英豪 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 王欢 (51)Int.Cl. C12N 5/0783 (2010.01) C12N 5/09 (2010.01) C12N 5/10 (2006.01) 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (54)发明名称 一种淋巴细胞的扩增体系及扩增方法 (57)摘要 本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一 种淋巴细胞的扩增体系及扩增方法。该扩增体系 包括组分1和组分2；组分1包括灭活的基因工程 细胞1、胎牛血清IL‑2和淋巴细胞基础培养基；组 分2为含灭活的基因工程细胞2的淋巴细胞基础 培养基；基因工程细胞1为表达CD80、IL21、IL12 的滋养细胞；基因工程细胞2为表达CD80、IL12的 滋养细胞。本发明利用该扩增体系与NK细胞共培 养，14天获得的NK细胞的存活率达92％，NK细胞 扩增倍数约5000倍，达到各种临床适合治疗病症 预期疗效应用要求；同时可以有效降低NK细胞的 应用成本，为NK细胞过继免疫治疗的广谱应用奠 A 定了基础。 7 5 1 3 5 5 2 1 1 N C CN 112553157 A 权利要求书 1/1页 1.一种淋巴细胞的扩增体系，其特征在于，包括组分1和组分2； 所述组分1包括灭活的基因工程细胞1、胎牛血清IL‑2和淋巴细胞基础培养基； 所述组分2包括灭活的基因工程细胞2和淋巴细胞基础培养基； 所述基因工程细胞1为表达CD80、IL21、IL12的滋养细胞； 所述基因工程细胞2为表达CD80、IL12的滋养细胞。 2.根据权利要求1所述的扩增体系，其特征在于，所述IL‑21为跨膜IL‑21；所述CD80为 跨膜CD80；所述IL‑12由IL‑12A和IL‑12B组成。 3.根据权利要求1所述的扩增体系，其特征在于，所述组分1中，IL‑2的浓度为20～ 400U/mL，胎牛血清的质量百分比含量为5～15％。 4.根据权利要求1所述的扩增体系，其特征在于，所述组分1和组分2的淋巴细胞基础培 养基为RPMI1640。 5.根据权利要求1所述的扩增体系，其特征在于，基因工程细胞1和基因工程细胞2的滋 养细胞为K562细胞。 6.权利要求1～5任一项所述的扩增体系在扩增淋巴细胞中的应用。 7.一种淋巴细胞的扩增方法，其特征在于，包括： 将PBMC或NK细胞接种至权利要求1～5任一项所述扩增体系的组分1中，培养； 向上述体系中加入权利要求1～5任一项所述扩增体系的组分2，再培养。 8.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述PBMC或NK细胞的接种密度为1× 6 10cell/mL。 9.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述基因工程细胞1与所述PBMC的细 胞数量比为1:1。 10.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述培养为37℃，5％CO条件下培养5 2 ～10天；所述再培养为37℃，5％CO 条件下培养5～10天。 2 2 2 CN 112553157 A 说明书 1/4页 一种淋巴细胞的扩增体系及扩增方法 技术领域 [0001] 本发明涉及细胞技术领域，尤其涉及一种淋巴细胞的扩增体系及扩增方法。 背景技术 [0002] NK细胞(自然杀伤细胞，Natural Killer Cell)行使着连接获得性免疫和固有免 疫桥梁的作用。一方面，当机体发生感染及创伤时，NK细胞以防御者的身份通过非肽‑MHC的 识别方式快速，广泛，特异地识别抗原，及时地清除病原微生物，变异细胞，发挥固有免疫的 作用。另一方面NK细胞被认为也部分参与了适应性免疫应答，能够影响αβT细胞和B细胞的 效应功能。 [0003] 在肿瘤的发生发展过程中，NK细胞既可以通过活化性受体直接识别肿瘤细胞并被 活化，也可以被辅助细胞(单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞等)活化。这些辅助细胞通过其 模式识别受体来应答内外环境的变化，再通过分泌多种可溶性因子或直接接触的方式将信 号传导给NK细胞。在人类，已经证实存在的可溶性因子有IL12，IL‑18，typeI IFN,TNF‑α等； 直接接触的分子有GITRL/GITR,CD48/2B4，MICA or MICB or ULBP1‑ULBP3/NKG2D,AICL/ NKp80等。基于以上原理在体外扩增活化的NK细胞对肿瘤细胞显示出良好的杀伤活性，并应 用于肿瘤生物治疗中。 [0004] 目前制约NK细胞的临床应用的主要障碍之一就是难以得到足够数量的NK细胞。如 何在体外实现NK细胞大规模扩增是目前NK细胞治疗的关键问题。外周血中NK细胞仅占很小 的部分。而肿瘤病人的外周血中往往NK细胞的数量和活性有明显的下降。不同人NK细胞的 性质有很大差异。寻找高效的个性化的NK细胞大规模扩增方法对NK细胞的临床应用有重大 意义。 [0005] 近年，人工抗原提呈细胞(使用基因工程技术制作的滋养层细胞)越来越多的用于 NK细胞的体外扩增。比如把膜结合IL15和4‑1BBL导入K562细胞，这种方法得到的人工抗原 提呈细胞可以将NK细胞在21天平均扩增277倍。把MICA和4‑1BBL导入K562细胞，并加以IL15 刺激NK细胞可在24天平均扩增550倍。把mIL21，4‑1BBL，CD64，CD86，tCD19导入K562细胞，这 种方法得到的人工抗原提呈细胞可以将NK细胞3周平均扩增一万倍以上。CN103484429A公 开了一种NK细胞的高效制备方法，即通过联合细胞因子和饲养细胞的刺激作用，提高NK细 胞的增殖速度和纯度。该发明将NCR3LG1和m IL‑15同时转染到K562细胞，mIL‑15可以调节 NK细胞的活化和增殖，而NCR3LG1作为NK细胞表面主要的活化受体之一NKp30的配体，可以 有效的刺激NK细胞活化，且两者有协同作用。再加上游离添加的IL‑2和IL‑21等因子的刺 激，可以在21天的培养时间内，使PBMC细胞数量得到超过500倍的增殖，CD3‑CD56+NK细胞的 比例超过70％。 [0006] 另外，免疫细胞有自然的生命周期，但受到细胞因子等活化会改变这个周期。被过 度活化的免疫细胞容易发生细胞死亡。免疫细胞过早死亡一方面影响了扩增效率，另一方 面死亡细胞可能会影响活的免疫细胞的增殖和活性，导致NK细胞用于临床治疗的安全性下 降。因此，在NK细胞的扩增倍数达到临床应用需求的同时需要更加重视细胞存活率的提高。 3 3 CN 112553157 A 说明书 2/4页 然而，目前现有技术培养的NK细胞存活率不够理想。因此，提供一种NK细胞存活率和扩增倍 数均较高的培养体系保证生物治疗的安全性具有重要的现实意义。 发明内容 [0007] 有鉴于此，本发明提供一种淋巴细胞的扩增体系及扩增方法。本发明扩增体系可 明显提高NK细胞的存活率和扩增倍数。 [0008] 星空体育网站 星空体育首页为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： [0009] 本发明提供一种淋巴细胞的扩增体系，包括组分1和组分2； [0010] 所述组分1包括灭活的基因工程细胞1、胎牛血清IL‑2和淋巴细胞基础培养基； [0011] 所述组分2包括灭活的基因工程细胞2和淋巴细胞基础培养基； [0012] 所述基因工程细胞1为表达CD80、IL21、IL12的滋养细胞； [0013] 所述基因工程细胞2为表达CD80、IL12的滋养细胞。 [0014] 本发明利用两种体系进行NK细胞扩增。一种培养体系(即组分1)包括表达CD80、 IL21、IL12A和IL12B的K562工程细胞1。另一种培养体系(即组分2)包括表达CD80、IL12A和 IL12B的K562工程细胞2。采用本发明扩增体系扩增NK细胞，NK存活率能达到92％，14天NK细 胞扩增约10000倍，达到各种临床适合治疗病症预期疗效应用要求；同时可以有效降低NK细 胞的应用成本，为NK细胞过继免疫治疗的广谱应用奠定了基础。 [0015] 一些实施方案中，所述IL‑21为跨膜IL‑21；所述CD80为跨膜CD80；所述IL‑12由IL‑ 12A和IL‑12B组成。 [0016] 一些实施方案中，组分1中，IL‑2的浓度为20～400U/mL。一些具体实施例中，IL‑2 的浓度为50U/mL。 [0017] 一些实施方案中，组分1中，胎牛血清的质量百分比含量为5～15％。一些具体实施 例中，胎牛血清的质量百分比含量为10％。 [0018] 一些实施方案中，所述组分1和组分2的淋巴细胞基础培养基为RPMI1640。 [0019] 一些实施方案中，基因工程细胞1和基因工程细胞2的滋养细胞为K562细胞。 [0020] 本发明还提供了所述的扩增体系在扩增淋巴细胞中的应用。 [0021] 本发明还提供了一种淋巴细胞的扩增体系及应用，包括： [0022] 将PBMC接种至本发明扩增体系的组分1中，培养； [0023] 向上述体系中加入权利要求本发明扩增体系的组分2，再培养。 [0024] 一些实施方案中，PBM 6 C或NK细胞的接种密度为1×10cell/mL。 [0025] 一些实施方案中，基因工程细胞1与所述PBMC的细胞数量比为1:1。 [0026] 一些实施方案中，基因工程细胞1与所述NK的细胞数量比为1:1。 [0027] 一些实施方案中，所述培养为37℃，5％CO 条件下培养5～10天；所述再培养为37 2 星空体育网站 星空体育首页℃，5％CO条件下培养5～10天。一些具体实施例中，所述培养的时间为7天。一些具体实施 2 例中，所述再培养的时间为7天。 [0028] 本发明提供一种淋巴细胞的扩增体系，该体系包括表达CD80、IL21、IL12A和IL12B 的基因工程细胞1以及表达CD80、IL12A和IL12B的基因工程细胞2。采用该扩增体系与NK细 胞共培养，获得的NK细胞的存活率达92％，14天NK细胞扩增倍数约5000倍，达到各种临床适 合治疗病症预期疗效应用要求；同时可以有效降低NK细胞的应用成本，为NK细胞过继免疫 4 4 CN 112553157 A 说明书 3/4页 治疗的广谱应用奠定了基础。 附图说明 [0029] 图1示本发明K562工程细胞1的结构示意图； [0030] 图2示本发明K562工程细胞2的结构示意图； [0031] 图3示不同扩增方法对NK细胞的扩增倍数，其中，灰色折线培养；黑色折线表示利用本发明扩增体系培养； [0032] 图4示本发明扩增方法扩增后的NK细胞的存活率；其中，灰色折线培养；黑色折线表示利用本发明扩增体系培养。 具体实施方式 [0033] 本发明提供了一种淋巴细胞的扩增体系及扩增方法。本领域技术人员可以借鉴本 文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术 人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳 实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和 应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。 [0034] 本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。 [0035] 下面结合实施例，进一步阐述本发明： [0036] 实施例1本发明基因工程细胞的制备 [0037] 构建稳定表达CD80、IL21、IL12A和IL12B的重组质粒，转染K562细胞，获得基因工 程细胞1以及稳定表达CD80、IL12A和IL12B的重组质粒，转染K562细胞，获得基因工程细胞 2。其中，跨膜白介素21或跨膜白介素12B是通过CD4的跨膜部分连接到细胞膜上，白介素 IL12A和CD80为跨膜蛋白。结构示意图如图1和图2所示。 [0038] 实施例2淋巴细胞扩增培养体系的制备 [0039] 将实施例1制备的基因工程细胞用于淋巴细胞的扩增，包括以下步骤： [0040] (1)灭活基因工程细胞：通过100Gy放射线分钟，获得灭活的基因工程细胞1 和基因工程细胞2； [0041] (2)配制组分1：取淋巴细胞培养液RPMI1640和10％胎牛血清，再向混合培养基加 6 入步骤(1)灭活的基因工程细胞1，添加量为1×10/mL，再添加IL‑2，IL‑2的添加量为50U/ mL。 [0042] (3)配制组分2：将基因工程细胞2与培养液RPMI1640混合。 [0043] 实施例3健康志愿者淋巴细胞的扩增 [0044] (1)培养：第0天采集新鲜健康志愿者血液，经离心收集血清储存，经淋巴分离液分 6 离获得人外周血单个核细胞(PBMC)，接种密度为1×10cell/mL，接种到实施例2步骤(2)的 培养体系中，其中，所述K562工程细胞1与所述PBMC的细胞数之比为1:1； [0045] (2)扩增：37℃，5％CO条件下培养7天，再加入K562工程细胞2，再培养7天； 2 [0046] (3)收获：培养结束后离心收集获得NK细胞。 [0047] 将单独使用K562工程细胞(在第0天和第7天添加)与PBMC共培养扩增NK细胞的方 法作为对照； 5 5 CN 112553157 A 说明书 4/4页 [0048] 采用自动细胞计数仪对扩增的NK细胞进行计数，并绘制曲线] 结果显示：NK细胞在单独K562工程细胞1(在第0天和第7天添加)的扩增条件下， PBMC细胞数量显著增加，NK细胞数量在7天时进入对数生长期，14天的时约增长了约8000 倍，细胞存活率为85％，如图3～4所示。 [0050] 本发明先后添加K562工程细胞1和K562工程细胞2的方法对PBMC进行培养，培养第 14天时NK细胞扩增约5000倍，细胞存活率达到92％，安全性得到明显提高，参见图3～4。 [0051] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。 6 6 CN 112553157 A 说明书附图 1/2页 图1 图2 图3 7 7 CN 112553157 A 说明书附图 2/2页 图4 8 8
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