1.本发明涉及细胞扩增技术领域，具体涉及一种大规模均匀扩增细胞球方法。
2.二维（2d）细胞扩增技术是目前细胞扩增最常用的方法之一，该方法操作简单且稳定，一个多世纪以来，2d细胞扩增被用作体外模型来研究细胞对来自生物物理和生物化学线d细胞扩增技术已被人们广泛接受，并显著提高了我们对细胞行为的理解，但其扩增状态与生物细胞真实生存环境仍有着很大差别，存在较多的缺点与局限性，如会降低生物细胞的分化潜能、改变生物细胞的表型、改变生物细胞的免疫调节特性以及无法模拟正常细胞生长生理环境。因此，为顺应发展需求，三维（3d）细胞扩增技术受到研究推广。
3.不同于传统2d细胞扩增技术的平面培养，3d细胞扩增技术模拟了组织的真实异质性和微环境，并提供细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用的信息，这为细胞-细胞信号转导、药物开发和分子靶标的验证提供了一种新方法，迄今为止，人们已开发数种3d细胞扩增方法，例如悬滴法、旋转瓶培养法和微图案板法，但仍存在不足，如细胞生长空间狭窄、不易给药或向培养基中添加因子以及工艺复杂等，使目前的3d细胞扩增技术不易扩大规模，且所获细胞球的大小往往是不均匀的，以致其不适用于高通量药物测试，因此需要一种可放大进行细胞球的大规模扩增、所获细胞球更为均匀且工艺简单易于操作的扩增方法。
4.为解决背景技术中存在的问题，本发明提出了一种大规模均匀扩增细胞球方法，包括以下步骤：步骤1、制备微孔芯片，将配制好的pdms（聚二甲基硅氧烷）液体转移至预设有均匀阵列微孔的硅片上，所述阵列微孔的孔径至少有一种，固化pdms，将固化完成pdms与硅片分离，按阵列微孔孔径分割固化完成的pdms获得微孔芯片；步骤2、将细胞悬液及其培养基引入微孔芯片的阵列微孔中，初步培养形成细胞球；步骤3、将初步培养的细胞球转移至搅拌扩增装置中，进行细胞球的动态扩增；所述搅拌扩增装置包括瓶体以及螺纹连接在瓶体上方瓶口处的瓶盖，所述瓶体内设有搅拌组件，搅拌组件包括搅拌承托、搅拌轴、固定夹和搅拌子，所述搅拌承托上方固定连接瓶盖内侧中心位置，搅拌轴上端转动连接在搅拌承托下方，搅拌轴下端固定连接有固定夹，搅拌子可拆卸连接在固定夹上，所述瓶体内壁上还涂有由pdms液体固化形成的pdms层。
5.优选的，所述步骤1具体为：1）按照pdms基本组分：固化剂=10:1的质量比均匀混合pdms基本组分和固化剂，制备pdms液体；2）将混合好的pdms液体置于真空干燥器中进行抽真空处理，通过真空处理使pdms
液体中的气泡浮至液体表面，处理完毕后对pdms液体进行消泡；3）将消泡完成的pdms液体转移至预设有均匀阵列微孔的硅片上，待pdms液体铺平；4）将铺平有pdms液体的硅片在65-150℃的温度范围内进行烘干，使pdms液体固化完全；5）将固化完全的pdms从硅片上分离，并按阵列微孔孔径大小进行分类切割，即得到微孔芯片；所述步骤2具体为：1）用pbs缓冲液冲洗单层细胞，并利用一定浓度的细胞消化液对单层细胞进行分离，将分离后的细胞悬浮在培养基中分散计数，随后在培养基中制备一定浓度的细胞悬液，用吸管或移液器将细胞悬液及其培养基一并引入阵列微孔中，细胞悬液及其培养基在重力作用下沉降到阵列微孔底部，将接种有细胞悬液及其培养基的微孔芯片放入培养箱中进行培养，初步形成细胞球；所述步骤3具体为：1）将初步培养的细胞球转移至瓶体内，组装搅拌扩增装置，利用搅拌扩增装置的搅拌组件对瓶体内的细胞球进行搅拌扩增。
6.搅拌扩增装置通过磁力搅拌器提供动力进行搅拌，在磁场作用下，搅拌子受磁力搅拌器控制产生转动，而固定夹使搅拌子处于在瓶体内中下端进行转动，带动瓶体内的细胞球进行充分混合。
7.优选的，所述硅片上的阵列微孔按孔径大小分类排布，相同孔径的阵列微孔位于同一阵列区域。
8.优选的，所述硅片上的阵列孔按直径可分为四类，四类阵列孔直径分别为0.2mm、0.3mm、0.4mm以及0.5mm。
9.优选的，所述搅拌承托内部设有直径不同的两个圆形孔洞且两孔洞连通，第一孔洞位于搅拌承托上部，第二孔洞位于搅拌承托下部，第一孔洞与第二孔洞相接处形成承托平面，所述第二孔洞直径大于搅拌轴直径，搅拌轴上端设置有与其垂直的金属杆，所述金属杆长度不大于第一孔洞直径并大于第二孔洞直径，搅拌轴上端通过金属杆卡设在承托平面处。
10.优选的，所述搅拌轴靠近上端面的轴体上贯穿设有安装孔，安装孔直径不小于金属杆直径，金属杆可穿入安装孔与搅拌轴可拆卸连接。
11.优选的，所述固定夹为空腔结构，固定夹安装端开口，所述搅拌子通过开口嵌入固定夹容腔中实现安装。
12.优选的，所述搅拌承托上方通过聚丙烯（pp）胶粘接固定到瓶盖内侧，在60-120℃的温度范围内烘干固化聚丙烯胶。
13.优选的，所述搅拌扩增装置中的搅搅拌承托、搅拌轴和固定夹由3d打印技术制备；所述瓶体材料选用低硼硅医药专用玻璃，所述瓶盖材料选用聚丙烯（pp），所述搅拌承托、搅拌轴和固定夹的材料选用尼龙12（pa12），所述金属杆的材料选用不锈钢。
14.本发明具有以下有益效果：1、 本发明利用微孔芯片进行均匀培养细胞球，微孔芯片的孔数多，可以一次性制备数量众多的细胞球，且每个微孔芯片上的孔大小均匀一致，使初步培养出的细胞球形态也均匀一致，同时利用搅拌扩增装置对初步培养的细胞球进行动态扩增，搅拌扩增装置的
搅拌承托、搅拌轴和固定夹由3d打印技术制备，基于3d打印技术制作时装置尺寸易于放大，细胞生长空间大，可一次性进行大体积的细胞球扩增，本发明综合利用了微孔芯片和搅拌扩增装置，能够实现细胞球的大规模均匀扩增，扩增过程工艺简单且易于操作。
15.2、 本发明的微孔芯片制作简单，无需复杂的化学技术，且微孔芯片的成分为聚二甲基硅氧烷，生物相容性好，适于细胞的培育。
16.3、 本发明的搅拌扩增装置的搅拌承托、搅拌轴和固定夹由3d打印技术制备，制作工艺简单，成本低且易于组装，搅拌扩增装置的瓶体内壁上涂有pdms液体，pdms液体固化形成透明pdms层，可防止细胞球沉底和贴瓶壁生长，同时搅拌扩增装置通过磁力搅拌器控制转速，细胞球的大小及形态与搅拌转速、剪切力有关，可通过控制搅拌扩增器转速来限制细胞球的大小，保持其形态均匀，另外搅拌扩增装置部分组件所用的材料pa12具有无生物毒性、耐高温高压不变形，以及低吸湿性的特性，可进行高压蒸汽灭菌，防止影响细胞球扩增体系。
17.4、 本发明有效模拟了生物细胞体内生长的真实环境，为细胞创造了适宜的扩增环境，既避免了细胞贴壁现象所导致的细胞球扩增限制，实现了细胞球的大规模扩增，又通过对微孔大小形状、搅拌速度的控制使培育出的细胞球大小形态均匀，可应用于高通量的药物测试，实现了大规模、均匀兼备的细胞球扩增，细胞球扩增中用到的装置制作和组装简单、生物相容性好且制作成本低，同时本发明的方法易于进行生长因子、培养基等物质的添加与更换，也无需专业复杂的化学技术及制作工艺。
18.图1为硅片整体示意图；图2为微孔芯片扩增细胞球实例；图3为搅拌扩增装置组成示意图；图4为搅拌轴和固定夹结构示意图；图5为搅拌轴和固定夹结构剖视图；图6为搅拌承托结构示意图；图7为搅拌承托结构剖视图；图8为搅拌子结构示意图；图9为带瓶盖的瓶体示意图。
19.图中标号：1-瓶体、2-瓶盖、3-搅拌承托、31-第一孔洞、32-第二孔洞、33-承托平面、4-搅拌轴、41-安装孔、5-固定夹、6-金属杆、7-搅拌子。
20.为使本发明更为清楚、明白，以下结合附图说明和具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，应当理解，所给出的实施例仅仅为实现方式的一种，并不代表所有实施例。
21.结合附图1-2，一种大规模均匀扩增细胞球方法，包括以下步骤：步骤1、制备微孔芯片，将配制好的pdms液体转移至预设有均匀阵列微孔的硅片上，所述阵列微孔的孔径至少有一种，固化pdms，将固化完成pdms与硅片分离，按阵列微孔
孔径分割固化完成的pdms获得微孔芯片，具体的，步骤1为：1）按照pdms基本组分：固化剂=10:1的质量比均匀混合pdms基本组分和固化剂，制备pdms液体；2）将混合好的pdms液体置于真空干燥器中进行抽真空处理，通过真空处理使pdms液体中的气泡浮至液体表面，处理完毕后对pdms液体进行消泡，真空处理时间根据pdms液体厚度形状、气泡数量进行选择，能够使所有气泡浮至pdms液体表面，便于消泡完全即可；3）将消泡完成的pdms液体转移至预设有均匀阵列微孔的硅片上，待pdms液体铺平；4）将铺平有pdms液体的硅片在65-150℃的温度范围内进行烘干，使pdms液体固化完全；5）将固化完全的pdms从硅片上分离，并按阵列微孔孔径大小进行分类切割，即得到微孔芯片；步骤2、将细胞悬液及其培养基引入微孔芯片的阵列微孔中，初步培养形成细胞球，细胞悬液的培养基及培养基中的物质与细胞类型有关，根据所要培育的细胞类型进行选用，具体的，步骤2为：1）用pbs缓冲液冲洗单层细胞，并利用一定浓度的细胞消化液对单层细胞进行分离，细胞消化液浓度根据细胞类型进行选用，将分离后的细胞悬浮在培养基中分散计数，随后在培养基中制备一定浓度的细胞悬液，用吸管或移液器将细胞悬液及其培养基一并引入阵列微孔中，细胞悬液及其培养基在重力作用下沉降到阵列微孔底部，将接种有细胞悬液及其培养基的微孔芯片放入培养箱中进行培养，初步形成细胞球，其中细胞悬液浓度、引入阵列微孔中的悬液体积和细胞数量根据实验需求选择，pbs缓冲液的ph根据不同细胞的最适ph进行选择。
22.步骤3、将初步培养的细胞球转移至搅拌扩增装置中，进行细胞球的动态扩增，具体的，将初步培养的细胞球转移至瓶体1内，组装搅拌扩增装置，利用搅拌扩增装置的搅拌组件对瓶体内的细胞球进行搅拌扩增。
23.如图1 所示，所述硅片上的阵列微孔按孔径大小分类排布，相同孔径的阵列微孔位于同一阵列区域，可通过设置不同孔径的阵列微孔来培育不同大小的细胞球。
24.优选的，所述硅片上的阵列孔按直径可分为四类，四类阵列孔直径分别为0.2mm、0.3mm、0.4mm以及0.5mm。
25.结合附图3-9，所述搅拌扩增装置包括瓶体1以及螺纹连接在瓶体1上方瓶口处的瓶盖2，所述瓶体1内设有搅拌组件，搅拌组件包括搅拌承托3、搅拌轴4、固定夹5和搅拌子7，所述搅拌承托3上方固定连接瓶盖2内侧中心位置，搅拌轴4上端转动连接在搅拌承托5下方，搅拌轴4下端固定连接有固定夹5，搅拌子7可拆卸连接在固定夹5上，所述瓶体1内壁上还涂有由pdms液体固化形成的pdms层，pdms层可防止扩增过程中细胞沉底和贴壁。
26.所述搅拌承托3内部设有直径不同的两个圆形孔洞且两孔洞连通，第一孔洞星空体育网站 星空体育首页31位于搅拌承托3上部，第二孔洞32位于搅拌承托3下部，第一孔洞31与第二孔洞32相接处形成承托平面33，所述第二孔洞32直径大于搅拌轴4直径，搅拌轴4上端设置有与其垂直的金属杆6，所述金属杆6长度不大于第一孔洞31直径并大于第二孔洞32直径，搅拌轴4上端通过金属杆6卡设在承托平面33处。
27.所述搅拌轴4靠近上端面的轴体上贯穿设有安装孔41，安装孔41直径不小于金属杆6直径，金属杆6可穿入安装孔41与搅拌轴4可拆卸连接。
28.所述固定夹5为空腔结构，固定夹5安装端开口，所述搅拌子7通过开口嵌入固定夹5容腔中实现安装，搅拌子7尺寸稍大于固定夹5容腔的尺寸，安装时按压搅拌子7使其嵌入固定夹5容腔内，取出时利用圆扁头镊子等小心撬出，注意避免划伤搅拌子7。
29.所述搅拌承托3上方通过聚丙烯胶粘接固定到瓶盖2内侧，将粘接后的搅拌承托3和瓶盖2置于烘箱中，在60-120℃的温度范围内对聚丙烯胶进行固化烘干，缩短其凝固时间，提高实验效率，固化时间与装置质量、所需温度和时间有关，根据实际情况选用烘干温度。
30.所述搅拌扩增装置中的搅拌承托3、搅拌轴4和固定夹5由3d打印技术制备，利用3d打印技术制备易于修改搅拌扩增装置尺寸规格，满足不同规模细胞扩增的需求，且制造成本大大降低；搅拌扩增装置的各组件需选用无生物毒性且满足高压灭菌锅的蒸汽湿热灭菌承受要求的材料，所述瓶体1材料选用低硼硅医药专用玻璃，所述瓶盖2材料选用pp，所述搅拌承托3、搅拌轴4和固定夹5的材料选用pa12，所述金属杆的材料选用不锈钢，不锈钢表面光滑，摩擦力小，利于转动，且不锈钢耐潮耐高温。
31.搅拌扩增装置通过磁力搅拌器提供动力进行搅拌，在磁场作用下，搅拌子7受磁力搅拌器控制产生转动，而固定夹5使搅拌子7处于在瓶体内中下端进行转动，带动瓶体1内的细胞球进行充分混合。
33.搅拌扩增装置组装过程：1）将搅拌子7嵌入固定夹5中，保证搅拌子7固定完好；2）将搅拌轴4上端从第二孔洞32穿过搅拌承托3，将金属杆6自搅拌轴4上端安装星空体育网站 星空体育首页孔41穿过，金属杆6放至第一孔洞31内并卡置在承托平面33上；3）固定好搅拌轴4的搅拌承托3上端涂上pp胶，再固定在瓶盖2内侧中心，将粘接后的各组件放入烘箱内烘干固化，加快pp胶的固化；4）配置pdms液体，将pdms液体均匀地旋涂于瓶体1内部，倒置烘干，在瓶体1内壁上形成pdms层；5）将瓶盖2螺旋安装到瓶体1上，使处理好的搅拌组件通过瓶盖2与瓶体1组装为一体。
34.以上实施方式只是阐述了本发明的基本原理和特性，但不受上述实施方式限制，应当明白，对于本领域的普通技术人员来说，可以在不脱离本发明精神和范围的前提下，对本发明进行各种变化和改变，这些变化和改变都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
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