猪细环病毒1型环介导等温扩增方法的建立,猪细环病毒1型环介导等温扩增方法的建立
内容提示：病毒颗粒在 QBI-293A 细胞中的大量扩增 录入时间: 2009-8-17 11: 48:47 来源： 青岛海博 一旦重组病毒已被纯化和鉴定， 即可在 QBI-293A 细胞中进行大量扩增。 本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法， 按这一方法最终得到的病毒量约为 3×1011~3×1012。 由于一个细胞中所含的病毒颗粒为 1000~10000， 因此 1L 培养细胞可得到约 5×1012 病毒颗粒。 如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化， 则必须至少 3×108 的细胞， 这样才能正确分辨出病毒带。 对于蛋白表达， 则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止， 离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽...
病毒颗粒在 QBI-293A 细胞中的大量扩增 录入时间: 2009-8-17 11: 48:47 来源： 青岛海博 一旦重组病毒已被纯化和鉴定， 即可在 QBI-293A 细胞中进行大量扩增。 本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法， 按这一方法最终得到的病毒量约为 3×1011~3×1012。 由于一个细胞中所含的病毒颗粒为 1000~10000， 因此 1L 培养细胞可得到约 5×1012 病毒颗粒。 如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化， 则必须至少 3×108 的细胞， 这样才能正确分辨出病毒带。 对于蛋白表达， 则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止， 离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提（根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀） 。 为优化时间进程， 每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。 如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存， 直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。 注意每次扩增都将会剩下一些病毒， 这星空体育网站 星空体育首页些病毒先不必丢弃， 以便下一步扩增失败时备用。 每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒， 这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。 操作步骤： 1. 在 100mm 培养皿或 75cm2 培养瓶中加入 10ml DMEM5%培养 5×106 QBI-293A 细胞。 2. 取 0. 5ul 首次扩增的病毒保存液， 加入 DMEM5%至 1ml， 混匀， 这样稀释应得到的 MOI 值约为 5。 3. 星空体育网站 星空体育首页移去培养液， 小心加入病毒混合液， 切勿破坏细胞单层， 十字形慢慢晃动 3 次， 37℃ CO2 孵箱中培养90 分钟。 4. 加入 9ml DMEM5%。 5. 再培养 72 小时， 这时在 10ml 溶液中大约有 5×109~5×1010 个病毒颗粒， 进行 MOI 测定以估计病毒颗粒（5. 3） 。 如果此时得到的病毒量已足够， 可立即进行病毒滴度测定（5. 8） 。 收集细胞， 600×g 离心 5 分钟沉淀细胞， 去上清后加入最小体积（一般为原始体积的 1/10 即 1ml） 病毒保存溶液重悬细胞。 -20℃/37℃冻融 3次， 台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片， 收集上清， 然后按 5. 8 进行病毒滴定。 6. -20℃/37℃冻融 3 次。 7. 转入 15ml 无菌离心管中， 台式离心机上以最大速率离心 10 分钟， 收集上清冻存于-20℃或-80℃。