对于荧光定量PCR的结果的判断，最直观的判断就是看扩增曲线是否正常。很多老师会遇到异常扩增曲线的困扰，接下来我们会结合几个实例，带着大家一起来看一下常见的异常扩增曲线的分析。
PCR扩增反应的最初的几个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，该直线叫做基线。
值为纵坐标，绘制线性曲线。而未知样品的拷贝数即可根据曲线方程计算得来。
）如果是做绝对定量，标准品的要求比较高，这个的制备过程也相对复杂一些，但结果也更加精确。
的反应体系是否符合要求，我们有时候也采用待测试样品作为标准品，逐步稀释后进行反应，最终看标准曲线
是否符合要求，我比较懒，常会用这种方法，不过有些发文章的要求会比较高，那还是要乖乖去做的。
简单点说，就是考察染料标记法结果的特异性的。再简单点，就是分分钟确定你的引物是否有效。
。如果反应产物单一，曲线会出现一个尖峰；如果有二聚体或者非特异性的扩增，就会出现至少两个峰或者更糟糕。采用
）溶解曲线的问题：比如多个峰，或者尖峰的前面有个小小的小峰，或者没有峰？
普通PCR耗材一般透光度比较差，会造成荧光扩增曲线异常，比如打折的扩增曲线（图三）。
荧光定量PCR 仪加热模块分0.2ml跟0.1ml两种，如果0.1ml加热模块用成0.2ml耗材，则会造成耗材压扁，甚至造成机器故障；如果0.2ml加热模块用成0.1ml耗材，则会造成反应管的外壁和荧光定量PCR仪器的温控模块没有充分接触，从而出现热传导不充分，进而影响酶的活性，会引起重复性不好（图四），或者溶解曲线多峰（非特异扩增），甚至是假阴性结果；
比如质量不好的耗材可能会引起荧光值不稳定，这会造成反应孔的自动基线扣除错误，得到不准确的CT值（图五左图），更换质量好的耗材后，荧光信号正常（图五右图）；
如果设置都正确，耗材及配件也都没问题，但是扩增曲线还是异常，这时候要确定下所用试剂是否正常。
首先要确定试剂是否有效，包括查看试剂是否在有效期内，是否反复冻融多次，运输条件是否正常。可以通过比较试剂的批次号，结合实验中的阳性对照结果，确定试剂的有效性。其次要观察扩增完的试剂体积，如果在扩增过程中有试剂的蒸发，可能会引起扩增曲线抬升现象，如果实验体系中加入了ROX作为参比荧光，ROX荧光可以区分扩增曲线抬升是真扩增，还是蒸发。
比如反应体系存在蒸发，水分丢失，ROX浓度会增加，ROX参比荧光上抬（图九左图），而正常孔中ROX荧光会一直不变（图九右图），所以在加完试剂上机前，一定要检查耗材是否已经密封，防止试剂蒸发，试剂蒸发严重的还可能导致整个实验室的气溶胶污染。
从冰箱冷冻中取出的试剂是否有混匀，如果试剂融化后没有混匀，这时候取出的试剂不是均一的，会影响后面的扩增；
定量PCR预混液跟核酸模板加好后是否混匀，如果没有混匀，特别是样本体积比较大的时候（超过PCR体系的20%），更容易发生optical mixing现象。因为样本是水相会在上层，试剂（含有甘油成分）会在下层，在前期的PCR过程中不足以混匀完全，这样会形成折射，荧光较强，而一般加热几个循环后样本跟预混液会混匀，荧光就变稳定了（图十）。
手动设置基线。将Baseline End设置为“扩增信号出现的前一个循环”即，图片展原始为26，将其设置为20，点击OK即可恢复正常曲线。
PCR实验首次检测呈斜直线型扩增曲线，再次复检后结果基本均为正常阴性。
分液不准确，检查检测后的反应管可发现管内的PCR反应液量明显少于正常管；
反应管气密性差，反应过程中溶液蒸发引起探针浓度增加，导致曲线呈斜直线状。
排除污染原因后复检样本，如果复检后曲线为阴性直线则说明之前的末尾起跳为非特异性扩增，如果复检后曲线仍与之前一致则说明末尾起跳表示该样本中待检病毒核酸的浓度偏低。
严重的蒸发会呈现先上升后下降的曲线，轻微的蒸发会是一种缓慢的上升，这两类异常星空体育登录入口 星空体育在线官网的曲线可以看一下检测后的反应管液面是否有下降的现象来证明。
（2）如果尖峰向下，可能是卤素灯老化所致发射光源不稳定（指卤钨灯光源的激发器）
（3）如果是单一的孔位出现尖峰，除了考虑仪器或者孔位问题外，还要考虑反应体系是否有气泡所致。