本发明涉及人类细胞培养技术领域，尤其涉及一种nk细胞体外培养扩增的方法。
nk细胞，又称自然杀伤细胞，是人体内一种重要的天然免疫系统淋巴细胞。其表型一般为cd3-cd16+cd56+。nk细胞的优势在于其不需抗原致敏和mhc限制就可以识别并杀伤肿瘤细胞，在机体抗肿瘤及早期抗病毒等免疫应答中起着重要作用。因此，nk细胞对肿瘤病人的治疗有很大的前景，但是nk细胞在体内所占的比例低、数量少，限制了nk细胞的应用，所以体外扩增nk细胞技术就开始发展。
目前体外扩增nk细胞的技术主要有三种：一是采用免疫磁珠细胞分选，从外周血单个核细胞得到纯化的nk细胞，在体外加入因子扩增培养；二是利用滋养层细胞k562细胞扩增原代nk细胞；三是直接利用因子刺激从外周血中扩增培养nk细胞。前两种扩增nk细胞的方法在临床上应用的安全性尚未得到验证，且k562细胞作为肿瘤细胞存在一定的风险，因此这两种方法多用于科研研究。第三种利用因子刺激扩增培养nk细胞星空体育官方入口 星空体育官网的方法安全性较好，临床应用价值高，但扩增倍数和纯度不高且不稳定。因此，寻找一种安全性好、扩增倍数高的nk细胞体外培养方法是很有必要的。
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种扩增方法简单、高效，有利于规模化生产的nk细胞的制备方法。
一种nk细胞体外扩增培养的方法，其创新点在于：无需滋养层细胞，利用含有肝素钠、cd16和人免疫球蛋白包被液包被培养瓶，激活nk细胞，通过il-2、il-15和il-18多种纯因子组合刺激nk细胞扩增，获得数量多、纯度高的nk细胞。具体步骤如下：
（1）培养瓶包被：用含有肝素钠、cd16和人免疫球蛋白的包被液铺满非tc处理的t75培养瓶底部，将培养瓶置于4℃冰箱静置。8-12小时后吸弃培养瓶内液体，并用pbs洗涤培养瓶2遍，用于以下操作。包被液中肝素钠含量为500u/ml、cd16含量为5ug/ml、人免疫球蛋白为1mg/ml。
（2）外周血采集：志愿者检测乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体，人免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、巨细胞病毒igm抗体等项目均为阴性。抽取50ml外周血，置于10ml无菌肝素钠采血管内，2～4h内分离。
（3）血浆的灭活：将外周血放入离心机离心，转速为3000rpm，时间10min。获得上层血浆和下层血液，取上层血浆在56℃温度下灭活30min，将灭活血浆在离心力为3000g的条件下离心10min，弃去底部血小板和补体，获得自体血浆，置于4℃无菌保存。
用生理盐水调整下层血液的细胞密度，调整细胞密度为4×106～10×106/ml，提前在50ml离心管中加入淋巴细胞分离液，将上述调整细胞密度的血液缓慢加入分离液上，可用移液管嘴在离心管壁小心划出几条通道，保证血液平稳的平铺在分离液上；将50ml离心管放入离心机，设置离心力为800g，升降档调至0-1档，离心30-40min，吸取单个核细胞层于50ml离心管中，加入生理盐水30～40ml，混匀置于离心机中，离心力300g，离心10min，弃上清液，重复洗涤2～3次。淋巴细胞分离液与血液的体积比例为1:1～1:3。
（5）种瓶：将细胞以1～2×106/ml的密度接种于事先被包被的t75培养瓶中，加入10ml无血清完全培养基培养，其中含有步骤（3）的自体血浆、il-2、il-15和il-18。放入37℃，5%co2培养箱培养。无血清完全培养基中自体血浆、il-2、il-15和il-18的含量分别为2.5wt.%～10wt.%、1000～1200u/ml、15～20ng/ml和20～25ng/ml。
（6）扩增：经过3天的静置培养，根据细胞的生长情况补加新鲜的无血清完全培养基或者只补加自体血浆和il-2、il-15、il-18因子，确保细胞密度在0.8×106/ml～1.2×106/ml。
（7）转瓶：当细胞数量过多时，把细胞转移到没有被包被过的t225培养瓶中，及时观察细胞的生长状况，每2～3天补一次液，同时保证细胞密度在0.8×106/ml～1.2×106/ml。自体血浆用完后则不再补加血浆。
（8）细胞的收获和检测：连续培养细胞14～18天之后，收获细胞，并取出一部分用于细胞计数和流式细胞分析。
本发明的提供的nk细胞培养方法安全性高，nk细胞经过培养激活后，扩增能力强，经过14～18天的培养，扩增倍数可达180～250倍，经流式细胞仪检测，nk细胞所占的比例在80%～95%，另外本发明中的扩增方法简单，高效，有利于规模化生产。
图3为实施例1nk细胞培养前细胞表型的流式图；cd3带fitc荧光，cd16带pe荧光，cd56带apc荧光。
图4为实施例1nk细胞培养后的细胞表型的流式图；cd3带fitc荧光，cd16带pe荧光，cd56带apc荧光。
一种nk细胞体外培养的方法，经过培养瓶coating、外周血采集、血浆的灭活、单个核细胞的分离、种瓶、扩增、转瓶、细胞的收获和检测，具体步骤如下：
（1）培养瓶coating：将肝素钠、cd16和人免疫球蛋白配置成混合溶液，其中肝素钠含量为500u/ml、cd16含量为5ug/ml、人免疫球蛋白为1mg/ml，吸取混合液5ml铺满非tc处理的t75培养瓶的底部，将培养瓶置于4℃冰箱静置。12小时后吸弃培养瓶内液体，并用pbs洗涤培养瓶2遍，待用。
（2）外周血采集：志愿者检测乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体，人免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、巨细胞病毒igm抗体等项目均为阴性。抽取50ml外周血，置于10ml无菌肝素钠采血管内，3h内分离。
（3）血浆的灭活：将外周血放入离心机离心，转速为3000rpm，时间10min。获得上层血浆和下层血液，取上层血浆在56℃温度下灭活30min，将灭活血浆在离心力为3000g的条件下离心10min，弃去底部血小板，获得自体血浆，置于4℃无菌保存。
（4）单个核细胞的分离：将生理盐水补加入下层血液中，调整细胞密度为5×106/ml。提前在50ml离心管中加入淋巴细胞分离液，将上述调整细胞密度的血液缓慢加入分离液上，可用移液管嘴在离心管壁小心划出几条通道，保证血液平稳的平铺在分离液上。将50ml离心管放入离心机，设置离心力为800g，升降档调至0档，离心30min。吸取单个核细胞层于50ml离心管中，加入生理盐水30ml，混匀置于离心机中，离心力300g，离心10min，弃上清液，重复洗涤3次。取一部分细胞用于做流式检测及细胞计数，流式结果见图3。淋巴细胞分离液与血液的体积比例为1:2。
（6）扩增：经过3天的静置培养，根据细胞的生长情况补加新鲜的无血清完全培养基（除自体血浆含量调整为2.5%外，其他配方不变），确保细胞密度在1×106/ml。
（7）转瓶：当细胞数量过多时，把细胞转移到没有被包被过的t225培养瓶中，及时观察细胞的生长状况，每3天补一次液，同时保证细胞密度在1×106/ml。自体血浆用完后则不再补加血浆。
（8）细胞的收获和检测：连续培养细胞14天，在第14天收获细胞。将所有的细胞置于250ml锥形离心管内离心，500g，离心15分钟。将细胞转移至一瓶离心管内，补加生理盐水洗涤细胞，重复操作3遍。取出一部分用于细胞计数和流式细胞分析，细胞收获总数为4.4×109，cd3-cd16+cd56+的nk细胞含量为90.6%，流式结果见图4。
（1）培养瓶包被：用含有肝素钠、cd16和人免疫球蛋白的包被液铺满非tc处理的t75培养瓶底部，将培养瓶置于4℃冰箱静置。10小时后吸弃培养瓶内液体，并用pbs洗涤培养瓶2遍，用于以下操作。包被液中肝素钠含量为500u/ml、cd16含量为5ug/ml、人免疫球蛋白为1mg/ml。
（2）外周血采集：志愿者检测乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体，人免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、巨细胞病毒igm抗体等项目均为阴性。取50ml外周血，置于10ml无菌肝素钠采血管内，2h内分离。
（3）血浆的灭活：将外周血放入离心机离心，转速为3000rpm，时间10min。获得上层血浆和下层血液，取上层血浆在56℃温度下灭活30min，将灭活血浆在离心力为3000g的条件下离心10min，弃去底部血小板和补体，获得自体血浆，置于4℃无菌保存。
将生理盐水补加入下层血液中，调整细胞密度为10×106/ml，提前在50ml离心管中加入淋巴细胞分离液，将上述调整细胞密度的血液缓慢加入分离液上，可用移液管嘴在离心管壁小心划出几条通道，保证血液平稳的平铺在分离液上；将50ml离心管放入离心机，设置离心力为800g，升降档调至0档，离心40min，吸取单个核细胞层于50ml离心管中，加入生理盐水40ml，混匀置于离心机中，离心力300g，离心10min，弃上清液，重复洗涤2次。淋巴细胞分离液与血液的体积比例为1:1。
（5）种瓶：将细胞以1×106/ml的密度接种于事先被包被的t75培养瓶中，加入10ml无血清完全培养基培养，其中含有步骤（3）的自体血浆、il-2、il-15和il-18。放入37℃，5%co2培养箱培养。无血清完全培养基中自体血浆、il-2、il-15和il-18的含量分别为5wt.%、1000u/ml、20ng/ml和25ng/ml。
（6）扩增：经过3天的静置培养，根据细胞的生长情况，补加新鲜的无血清完全培养基，确保细胞密度在1.2×106/ml。
（7）转瓶：当细胞数量过多时，把细胞转移到没有被包被过的t225培养瓶中，及时观察细胞的生长状况，每2天补一次液，同时保证细胞密度在1.2×106/ml。自体血浆用完后则不再补加血浆。
（8）细胞的收获和检测：连续培养细胞18天之后，收获细胞，并取出一部分用于细胞计数和流式细胞分析。细胞收获总数为5.1×109，cd3-cd16+cd56+的nk细胞含量为94.6%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
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