本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种神经纤维瘤细胞系及其构建方法和应用。
ⅰ型神经纤维瘤病(neurofibromatosistype1，nf1)是一种由nf1基因突变引起的常染色体显性遗传疾病。nf1在新生儿中的患病率约为1/3500～1/3000(美国流行病学杂志,2000,151(1):33-40；神经科学史杂志,2010,19(4):333-348)。神经纤维瘤是nf1中最为常见和具有特征性的症状之一，神经纤维瘤中有着大量增生的施旺细胞和其他神经纤维支持成分，如神经束膜细胞、成纤维细胞、血管和浸润其中的肥大细胞。神经纤维瘤主要分为皮肤型神经纤维瘤和丛状型神经纤维瘤，皮肤型神经纤维瘤不具备恶变潜能，而丛状型神经纤维瘤多呈现浸润性生长，破坏肿瘤周围正常组织和器官，同时具有恶变倾向，且手术疗效欠佳。因此，成为当前多组学及靶向治疗研究热点。
然而，神经纤维瘤为良性肿瘤，在体外研究中，与多数恶性肿瘤不同的是，其神经纤维瘤细胞不具备永生性，在体外很难长久存活，难以开展研究。目前国际上公认的神经纤维瘤来源的细胞系均来自国外，可在atcc(上查询及购买，缺乏针对中国人遗传背景的神经纤维瘤细胞系。
因此，需要一种神经纤维瘤细胞系，尤其是具备永生性的具有中国人遗传背景的神经纤维瘤细胞系，及其构建方法，以推进对于ⅰ型神经纤维瘤病的研究。
本发明的目的在于提供一种神经纤维瘤细胞系，尤其是一种来源于人i型神经纤维瘤病的神经纤维瘤细胞系，所述神经纤维瘤细胞系具有中国人遗传背景，并且具备永生性。
为了达到上述目的，根据本发明的一方面，提供一种神经纤维瘤细胞系，尤其是一种来源于人i型神经纤维瘤病的神经纤维瘤细胞系，命名为神经纤维瘤细胞系pnf1-9hosp-01，保藏中心保藏编号为cctccno:c202006。保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，保藏单位代码为cctcc-中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉，保藏时间为2020年4月6日。
根据本发明的另一方面，提供上述神经纤维瘤细胞系的构建方法，所述构建方法是向原代分离的神经纤维瘤细胞转染端粒酶逆转录酶基因和cdk4/m抗原，经单克隆筛选以获得永生化神经纤维瘤细胞系。
在一些实施例中，在所述构建方法中，先向原代分离的神经纤维瘤细胞转染端粒酶逆转录酶基因，然后继续转染cdk4/m抗原。
在一些实施例中，在所述构建方法中，通过慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对所述原代分离的神经纤维瘤细胞转染端粒酶逆转录酶基因和cdk4/m抗原。
步骤s1：提供原代神经纤维瘤细胞，对所述原代神经纤维瘤细胞进行培养，以得到待转染细胞培养物；
步骤s2：以慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对待转染细胞培养物进行病毒感染，并在病毒感染的过程中进行培养基置换；以及，
步骤s3：对经病毒感染后的细胞培养物进行单克隆筛选并再传代培养，以得到永生化神经纤维瘤细胞系；其中，
在所述步骤s2中，以慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对所述待转染细胞培养物转染端粒酶逆转录酶基因，moi值为30，在病毒感染的过程中进行培养基置换；随后，再以慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对经转染端粒酶逆转录酶基因的细胞培养物转染cdk4/m抗原，moi值为30，在病毒感染的过程中进行培养基置换；并且，在所述步骤s2中，所述病毒感染增强悬液的工作浓度为5～8μg/ml。
在一些实施例中，在所述步骤s2中，所述待转染细胞培养物中原代神经纤维瘤细胞的浓度为8μg/ml。
步骤s11：将剪切后的神经纤维瘤组织置入含10％(v/v)胎牛血清、1.25u/ml分散酶、300u/ml胶原酶、100u/ml青霉素及100ug/ml链霉素的l15培养基中，37℃过夜后经30μm细胞滤网过滤以收集细胞，以层黏连蛋白包被细胞后置于含15％胎牛血清、25ng/ml的hnrg-1、100u/ml青霉素及100ug/ml链霉素的l15培养基中，以获得原代神经纤维瘤细胞；以及，
步骤s12：以包被液对培养容器进行包被，将消化好的细胞均匀铺于经包被的培养容器中，37℃、5％co2环境中密封培养，以获得待转染细胞培养物。
在一些实施例中，在所述步骤s12中，以胰酶消化所述步骤s11中获得原代神经纤维瘤细胞。
在一些实施例中，在所述步骤s1中，l15培养基中不含有heps缓冲液，并且需要进行密封培养。
步骤s21：将所述待转染细胞培养物以每孔6×105/2ml的接种密度接种至到孔板中，37℃、5％co2环境中孵育；
步骤s22：对孵育后的孔板更换新鲜培养基，并依次加入所述病毒感染增强悬液和所述慢病毒悬液，以对所述待转染细胞培养物转染端粒酶逆转录酶基因；其中，moi值为30，所述病毒感染增强悬液的工作浓度为5～8μg/ml，并且，在病毒感染的过程中进行培养基置换；
步骤s23：再以慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对经转染端粒酶逆转录酶基因的细胞培养物转染cdk4/m抗原；其中，moi值为30，所述病毒感染增强悬液的工作浓度为5～8μg/ml，并且在病毒感染的过程中进行培养基置换；以及，
在一些实施例中，在所述步骤s24中，对经转染端粒酶逆转录酶基因及转染cdk4/m抗原的细胞培养物传代至少9代以上。。
步骤s31：将步骤s23获得的细胞培养物稀释至500cell/ml的密度，并以二倍稀释法接种至孔板中，于37℃、5％co2的环境中培养，一周后观察孔板中细胞克隆形成的情况，挑选单克隆的细胞孔；以及，
步骤s32：每24～72小时更换培养基，细胞长满皿底的70％～80％时进行消化传代，分种率为1:2。
本领域技术人员可以理解的是，如无特殊说明，本发明中使用的试剂为市售商品。
1、本发明所述pnf1-9hosp-01细胞系是中国第一株自主建立的来源于人i型神经纤维瘤病的良性肿瘤细胞系，具有中国人的遗传背景，与国外已有细胞系对相比，在研究中国人i型神经纤维瘤病中具有无法比拟的优势。
2、一般情况下，无论是良性还是恶性肿瘤，其从体内转移到体外培养后，由于微环境的改变二不易存活，因此在一般体外培养条件下要使肿瘤细胞传代是十分困难的，使得针对原代细胞进行的研究推进较难。而本发明所述的pnf1-9hosp-01细胞为永生化的星空体育官方入口 星空体育官网良性细胞，根据本发明给出的培养条件，可在体外稳定存活及传代，为神经纤维瘤相关的研究提供了良好的材料。
3、本发明所述pnf1-9hosp-01细胞的构建方法，具有良好的可借鉴性和推广性，可以有效、经济地建立i型神经纤维瘤病的良性肿瘤细胞系。
图2：单层贴壁生长的pnf1-9hosp-01细胞(20x)，可见较多新生细胞，细胞为簇样生长，其形状不规则，排列紧密，界限清晰，接触性抑制丧失。
图3a、3b、3c：pnf1-9hosp-01细胞扫描电镜(2000x)，细胞表面有皱褶，周围有微绒毛或突出。
图4：pnf1-9hosp-01细胞的生长曲线细胞接种后贴壁率随时间变化图，种植6小时后，大部分细胞(95％以上)均可贴壁生长。
图7：细胞类型鉴定流式图，该细胞系中92.93％为s100b(+)肿瘤细胞。
图8：pnf1-9hosp-01细胞免疫荧光，图中绿色：s100b，蓝色：dapi。可见s100b主要表达在胞浆中。
以下，结合具体实施方式，对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。
在本实施例中，提供一种神经纤维瘤细胞系，尤其是一种来源于人i型神经纤维瘤病的神经纤维瘤细胞系，命名为pnf1-9hosp-01，保藏中心保藏编号为cctccno:c202006。
所述神经纤维瘤细胞系的构建方法是向原代分离的神经纤维瘤细胞转染端粒酶逆转录酶基因(tert)和cdk4/m抗原，经单克隆筛选以获得永生化神经纤维瘤细胞系。并且，所述构建方法包括以下步骤：
步骤s11：将剪切后的神经纤维瘤组织置入含10％(v/v)胎牛血清、1.25u/ml分散酶、300u/ml胶原酶、100u/ml青霉素及100ug/ml链霉素的l15培养基中，37℃过夜后经30μm细胞滤网过滤以收集细胞，以层黏连蛋白包被细胞后置于含15％胎牛血清、25ng/ml的hnrg-1、100u/ml青霉素及100ug/ml链霉素的l15培养基中，以获得原代神经纤维瘤细胞；
步骤s12：以包被液对培养容器进行包被，将消化好的细胞均匀铺于经包被的培养容器中，37℃、5％co2环境中密封培养，以获得待转染细胞培养物；
/2ml的接种密度接种至到孔板中，37℃、5％co2环境中孵育；步骤s22：对孵育后的孔板更换新鲜培养基，并依次加入所述病毒感染增强悬液和所述慢病毒悬液，以对所述待转染细胞培养物转染端粒酶逆转录酶基因；其中，moi值为30，所述病毒感染增强悬液的工作浓度为5～8μg/ml，并且，在病毒感染的过程中进行培养基置换；
步骤s23：再以慢病毒悬液和病毒感染增强悬液对经转染端粒酶逆转录酶基因的细胞培养物转染cdk4/m抗原；其中，moi值为30，所述病毒感染增强悬液的工作浓度为5～8μg/ml，并且在病毒感染的过程中进行培养基置换；
步骤s31：将步骤s23获得的细胞培养物稀释至500cell/ml的密度，并以二倍稀释法接种至孔板中，于37℃、5％co2的环境中培养，一周后观察孔板中细胞克隆形成的情况，挑选单克隆的细胞孔；以及，
步骤s32：每24～72小时更换培养基，细胞长满皿底的70％～80％时进行消化传代，分种率为1:2。
在所述步骤s24中，对经转染端粒酶逆转录酶基因及转染cdk4/m抗原的细胞培养物传代至少9代以上。
所述步骤s22及所述步骤s23中，所述病毒感染增强悬液为聚凝胺悬液(polybrene)。
在一具体实施例中，标本来源为上海交通大学附属第九人民医院整复外科患者黄xx，男，18岁，术前患者征得患者本人及监护人同意，签署知情同意书，术中切除的臀部丛状型神经纤维瘤标本。术后病理诊断为：神经纤维瘤(病理号：18-19566)。
)，含1％双抗(青霉素100u/ml、链霉素100ug/ml)的l15培养基冲洗切除的组织，将切除的组织置于含10％胎牛血清的l-15培养基中，冰盒运输。在超净台中用灭菌的交叉外科解剖刀对组织进行剪切，将剪切后的组织置于10ml含10％胎牛血清、1.25u/ml分散酶,300u/ml胶原酶和1％双抗的l15培养基中于37℃培养箱中过夜。30μm细胞滤网过滤至50ml离心管中，500g离心5min。收集细胞沉淀，将细胞培养在laminin(10μg/ml)包被后含15％胎牛血清、hnrg-1(25ng/ml)和1％双抗的l15完全培养液的密闭型t25培养瓶中；原代培养前准备：用1ml包被液对培养瓶进行包被(10ug/ml的laminin层黏连蛋白稀释于pbs，稀释比为1:100；例如10ul1mg/ml储液稀释于1mlpbs，终浓度为10ug/ml)，培养箱放置2h，吸弃多余上清，pbs轻洗一遍。
原代细胞传代：小心吸去培养液，用1xpbs清洗；弃掉1xpbs后，加入适量胰酶；在显微镜下观察细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。弃去胰酶，加入适量预热的新鲜培养液，将细胞吹打分散均匀，将细胞悬液吸入15ml离心管中，室温，800rpm，离心5min，弃去培养液，加入新鲜培养液，将细胞吹打均匀。将消化好的细胞均匀的铺于提前包被好的细胞瓶中，37℃、5％co2，使用密封培养瓶培养。
细胞准备:稳转细胞建系前，确保目的细胞状态良好，例如图1所示的光镜观察下的原代细胞第5代(20x)。小心吸去培养液，用1xpbs清洗；弃掉1xpbs后，加入适量胰酶；在显微镜下观察细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。弃去胰酶，加入适量预热的新鲜培养液，将细胞吹打分散均匀，将细胞悬液吸入15ml离心管中，室温，800rpm，离心5min，弃去培养液，加入新鲜培养液，将细胞吹打均匀，血球计数板计数。以6×10
/2ml的密度加入到6孔板中；细胞培养箱，37℃，5％co2，孵育24h；取出6孔板，换新鲜培养液2ml/孔；转染端粒酶逆转录酶基因：依次加入8μg/ml的polybrene和25μl/孔的慢病毒悬液(tert病毒)，moi值为30，神经纤维瘤细胞的浓度为8μg/ml，每6小时更换新鲜培养基，转染72小时；
转染cdk4/m抗原：依次加入8μg/ml的polybrene和25μl/孔的慢病毒悬液(cdk4/m病毒)，moi值为30，神经纤维瘤细胞的浓度为8μg/ml，每6小时更换新鲜培养基，转染72小时；
传代：对经转染端粒酶逆转录酶基因及转染cdk4/m抗原的细胞培养物进行传代，至少9代以上。收集存活的细胞，此时的细胞为永生化细胞。
准备细胞悬液，稀释至500cell/ml的密度，移液枪向96孔板中的a1孔移取200ul稀释后的液体。移液器向96孔板中除a1孔的其它孔添加100ul培养基。从a1孔中吸取100ul培养基至b1孔，轻轻混匀，避免产生气泡。从b1孔中吸取100ul混匀后的液体至c1孔。以此类推至h1孔。向a1-g1孔添加100ul培养基。从a1孔吸取100ul混匀后的培养基至a2孔，轻轻混匀，避免产生气泡。混匀后从a2孔吸取100ul培养基至a3从，以此类推至a12孔。(b1-b12重复此步骤)96孔板中终体积不足200ul的孔添加细胞培养基补足。将96孔板置于37℃，5％co2的培养箱中培养，一周后观察孔板中细胞克隆形成的情况。挑选单克隆的细胞孔并记录。
根据细胞的状态及培养液颜色的变化，每隔2～3天更换l15完全培养基，细胞长满皿底的70％～80％即应及时消化传代，分种率1：2，其中1瓶继续培养，1瓶冻存留种。
在本实施例中，提供本发明所述神经纤维瘤细胞系pnf1-9hosp-01的验证方法。包括以下几部分。
1.1.2光镜：在倒置相差显微镜下观察培养的活细胞形态结构及其生长特点。
取生长良好的对数生长期细胞(第20代)，胰酶消化细胞，轻轻吹匀，倍比稀释，以每孔100ul星空体育官方入口 星空体育官网(2×10
个细胞)接种于96孔板，使每孔中的细胞终浓度为2×103个/ml，每组6个复孔。共需准备7组。24小时后，将一组的6孔细胞中的培养液换成100ul含10％cck8的无血清培养液，同时在96孔板上取6个空白孔中加入100ul不含cck8的无血清培养液用作空白对照，37℃孵育2小时后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。连续7天，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。用半高度法计算细胞倍增时间。计算公式：dt＝t×lg2/lg(nt/no)。其中dt为细胞倍增时间，t为培养时间，no为首次记下的od值，nt为t时间后的od值。1.2.2细胞贴壁率
取对数生长期细胞，观察细胞生长良好，胰酶消化细胞，轻轻吹匀，稀释悬液，计数，以每孔1×10
接种于24孔板中，共8孔，于0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h时分别使用pbs轻轻洗去未贴壁的细胞，使用4％多聚甲醛固定贴壁细胞，0.1％结晶紫染色后倒置显微镜下拍照，计数贴壁细胞数量，每孔取5个随机视野。以10h时的细胞贴壁数量为最终贴壁数，计算0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h时的细胞贴壁率，并绘制贴壁率随时间变化图。1.3染色体分析
取生长状况好的细胞进行传代种板，次日观察细胞生长至80％融合度，加入秋水仙素至终浓度为0.2μg/ml，继续置于37℃培养箱中培养2h。培养结束后，用0.25％胰酶消化细胞，然后以完全培养基终止消化，再将其转入15ml离心管中，1000rpm离心8min，弃上清液。用移液器轻轻吹散细胞悬液。逐滴滴加5ml低渗液(0.5％kcl溶液)，并将细胞均匀分布于悬液中，放至37℃水浴作用20min。加入新鲜配制的固定液2ml(甲醇：冰醋酸＝3：1)，预固定2-3min。800rpm离心8min，弃上清。再滴加新鲜的固定液5ml，重悬混匀，固定40min，然后800rpm离心8min，弃上清。此固定操作重复2次。固定结束后，用移液器轻轻吹散细胞。吸取细胞悬液，滴至预冷的载玻片上，将载玻片掠过酒精灯几次，室温下干燥。取出玻片，滴加giemsa工作液，完成覆盖即可，染色20-30min。自来水冲洗终止染色，待自然风干后镜检。低倍镜做全面查，找出染色体分散均匀，长短适中的中期分裂相，然后转换高倍镜(400x)，以油镜观察后拍照。通过图片计算染色体数目并观察其特征，并进行染色体核型配对。以imagej软件量取染色体长臂和短臂长度数值，并进行相应计算。每个样本至少选取30个染色体组进行计数，并算出核型正常的比。
个细胞)对pnf1-9hosp-01细胞进行流式细胞仪分析。取100ul细胞悬液(细胞计数后用流式染色缓冲液调整浓度为1×107/ml)，加入0.5ug一抗，室温避光孵育15-30min，加入1～2ml流式染色缓冲液洗一次，用100ul流式染色缓冲液重悬，加入0.1ul小鼠来源荧光二抗避光孵育15-30min，加入1～2ml流式染色缓冲液洗一次，300g离心5min，弃上清，用500ul流式染色缓冲液重悬，立即上机检测。1.5细胞免疫荧光
制备细胞爬片，4％多聚甲醛固定后进行细胞免疫荧光s100b(sigma，s2532，1：500)染色。用含0.1％tritonx-100的pbs室温孵育10分钟进行通透。用pbs洗涤爬片3次，每次5分钟。用3％bsapbst(pbs+0.1％tween20)室温孵育30分钟进行封闭。用新鲜配置的封闭液稀释抗体(1：500)在湿盒中孵育1小时，37℃。用pbs洗涤3次，每次5分钟。用封闭液稀释二抗室温下避光孵育1小时。用pbs避光洗涤细胞3次，每次5分钟。滴加dapi进行核复染。倒置荧光显微镜下拍照，-20℃保存爬片。
在本实施例中，提供本发明所述神经纤维瘤细胞系pnf1-9hosp-01依据上述验证方法获得的验证结果。
2.1.1大体形态：如图2所示，可见较多新生细胞，细胞为簇样生长，其形状不规则，排列紧密，界限清晰，接触性抑制丧失。
2.1.2光镜：如图2所示，在倒置相差显微镜下观察培养的活细胞，大多呈多角形，胞浆丰富，核大而圆，核仁多个而明显，可见核分裂象。
2.1.3电镜：如图3a、3b和3c所示，扫描电镜显示细胞表面有皱褶，周围有微绒毛或突出。
2.2.1细胞生长曲线的绘制及细胞群体倍增时间：细胞的7天生长曲线所示。利用半高度法计算细胞倍增时间为16.16小时。
2.2.2细胞贴壁率：如图5所示的细胞贴壁率随时间变化，种植6小时后大部分细胞(95％以上)均可以贴壁生长。
如图6所示，本发明所述神经纤维瘤细胞系pnf1-9hosp-01的染色体核型为：56，xy。异常染色体核型不仅显示了染色体数量上的非整倍体性，同时还伴随有长臂、短臂部分缺失及短臂整体缺失等异常现象。
如图7所示，利用流式细胞仪检测，本发明所述神经纤维瘤细胞系pnf1-9hosp-01的s100b(+)细胞含量在92.93％。
如图8所示，利用细胞免疫荧光法，检测到施旺细胞特异性标记物s100b主要在胞浆内表达。
本发明所述pnf1-9hosp-01细胞系是中国第一株自主建立的来源于人i型神经纤维瘤病的良性肿瘤细胞系，具有中国人的遗传背景，与国外已有细胞系对相比，在研究中国人i型神经纤维瘤病中具有无法比拟的优势。本发明所述的pnf1-9hosp-01细胞为永生化的良性细胞，根据本发明给出的培养条件，可在体外稳定存活及传代，为神经纤维瘤相关的研究提供了良好的材料。
本发明已由上述相关实施例加以描述，然而上述实施例仅为实施本发明的范例。必需指出的是，已公开的实施例并未限制本发明的范围。相反地，包含于权利要求书的精神及范围的修改及均等设置均包括于本发明的范围内。
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