Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix扩增的预溶液，具有高灵敏度和高特异性的特点，颜色为蓝色，具有加样示踪的作用。核心组分聚合酶采用抗体法热启动，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增。同时配方添加了提升
本产品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。
本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。
1.推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（货号：11141ES），以有效去除RNA样品中残留的基因组。
2.解冻后Master Mix可能出现絮状或白色沉淀，手握缓慢溶解并上下轻柔颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。
a)引物浓度：通常引物终浓度为0.2 M，也可以根据情况在0.1-1.0 M之间进行调整。
b)模板浓度：如模板为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
c)模板稀释：cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的Ct值在20-30个循环为好。
d)反应体系：推荐使用20 L或50 L，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
e)体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
b)荧光信号采集（★）：请勿忘记打开荧光信号采集，按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：
Ct值介于30-35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；
熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。
熔解曲线出现双峰，需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。
2.正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。
3.引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3端最后一个碱基最好为G或C。
5.引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3端有2个碱基以上的非特异性互补。
6.设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。
A：常用 2 步法。需提高扩增特异性，可选用 2 步法或提高退火温度。在扩增效率低， ct 值过大的时候，可以改用 3 步法或延长延伸时间。
A：有效性要满足三个条件：（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为-3--3.5。R2＞0.98。(扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-星空体育登录入口 星空体育在线官网3.32 时，扩增效率=100%。（2）扩 增曲线：S型曲线，且Ct值在15－35之间，阴性对照Ct＞35或无Ct值。（3）熔解曲线：为单一峰。
Ct值大于15个循环是因为3-15个循环的荧光值标准差的10倍是荧光阈值，Ct值太小了会影响曲线。
A：同样的扩增产物也会出现Tm 值有微小差异，一般差异在 1 度以内都可以接受。
A：一般CT值与模板起始浓度呈负相关，浓度越高，CT 值越小。但也有很多特殊情况， 比如体系中存在抑制物或是模板不纯，这时候稀释模板反而能使CT值变低。
A：(1)X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板DNA 进行稀释（一般推荐 5-10 倍），然后模板量梯度上样，选择 CT 值落在 20-30 之间的最佳上样量。
b)3-15 个循环的荧光值标准差的 10 倍是荧光阈值，Ct 值太小了会影响曲线。
A:ROX 是一种参比染料，其作用是标准化荧光定量反应中的非PCR 震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。
A: 试剂中含有稳定性成分，本身不参与任何反应，但在电泳胶上面会表现出弥散状，不建议跑完后再电泳。
枪头加样不要把空气打进去，二档吸样，一档打样品；缓慢推出液体，不要吹打；沿着壁打入到孔内；
另外配置完后，如果还有气泡，离心PCR管去除。如果是96孔板，移液完后轻轻敲96孔板。