上期详细介绍了DNA结合染料法的qPCR实验步骤，那么在实验中，大家或多或少会遇到扩增曲线异常、熔解曲线异常和重复性不好等问题，本期将详细介绍这些问题以及相应的解决方法。
Q2：扩增曲线：可能是基线范围设置不当，这种一般是由于模板量过高导致的，建议减小基线：扩增曲星空体育 星空体育平台线：RNA纯度低，建议梯度加大模板稀释倍数看优化效果或重新制备高纯度RNA重新实验。也可能是仪器长时间未校准，需定期进行仪器校准保养。
熔解曲线常用来判断qPCR结果的特异性，理想的熔解曲线 熔解曲线：一种可能性是引物特异性较差导致非特异性扩增，建议重新设计引物。另一种可能性是出现了DNA污染，需重新制备模板。
Q2：双峰，较低峰Tm在80℃之前。A2：可能存在引物二聚体，其在熔解曲线℃左右，可通过琼脂凝胶电泳确认引物二聚体。可通过摸索最佳的Tm值和适当降低引物浓度避免引物二聚体。
Q3：溶解曲线）反应体系污染，建议重新制备模板；（2）试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效，建议更换试剂；（3）仪器长时间未校准需定期进行仪器校准保养。
A1：许多技术方面的因素会造成重复性的损失，如移液不精确、组分混合不完全、反应孔中有气泡、孔边缘的信号下降、在管/板盖上做标记等。为提高重复性，要小心移液，确保反应组分混合均匀，离心样品以去除气泡，确保所有组分位于反应管孔底部，并且不在管盖上做标记。
绝对定量中，使用仪器自带软件进行分析，以Ct值对稀释倍数的对数作图（纵坐标为Ct值，横坐标为log模板数），计算斜率和R2值。
当扩增效率为100%，斜率为-3.32，当斜率在-3.10 ~ -3.58范围内，即扩增效率为90% ~ 110%时，都属于正常范围。R2最佳值为1，一般大于0.98即可。若结果不理想，可参考以下内容。
A1：低扩增效率说明引物设计星空体育 星空体育平台得不好、反应条件不合适或有移液误差。为提高扩增效率，需要优化引物浓度，设计合适的引物，并小心移液以尽量避免移液误差。
Q2：PCR 扩增效率太高。A2：效率超过 100%可能是因为样品中的抑制剂导致高浓度样品 Ct 值滞后，PCR抑制剂可来源于原始材料（如蛋白质或多糖），也可由核酸提取过程引入（如SDS、苯酚、乙醇、蛋白酶K、离液剂或乙酸钠），此时，可尝试用其他适合该样品类型的试剂盒对提取的 DNA 样品重新提取。
1、不同公司的qPCR仪器适配的耗材和试剂可能不同，提前阅读仪器说明书或咨询仪器工程师、实验室人员等确认，仪器和耗材或实际不兼容可能会导致结果偏差，实验前一定要确认好哦。
2、qPCR板上不能做标记，极有可能影响荧光信号的采集，若担心加样有误可使用实验记录本协助记忆。
至此，qPCR实验详解内容就结束了，下期将开始介绍WB相关内容，感兴趣的小伙伴可以留意一下哦~