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[精品论文] hippotaz信号通路对细胞生长调控的研究
复旦大学 博士学位论文 Hippo--TAZ信号通路对细胞生长调控的研究 姓名：****申请学位级别：博士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：**良；熊跃 2010-04-13 复旦大学博士毕业论文 摘要 ＨｉｐｐｏＰａｔｈｗａｙ是首先在果蝇中发现的一个新的信号转导通路，通过协调 细胞增殖和细胞凋亡在果蝇发育过程中起到控制细胞数量和器官大小的作用。其 核心部分由一个级联的激酶系统构成，通过磷酸化下调Ｙｏｒｋｉｅ的转录激活作用， 从而达到控制细胞数量和器官大小的作用。该机制的失效将导致果蝇器官庞大和 组织的肿瘤样生长。在哺乳动物细胞中存在和果蝇高度保守的ＨｉｐｐｏＰａｔｈｗａｙ， 构成该信号通路的各编码基因在多种人类肿瘤组织中存在表达沉默或功能丧失 的突变，并且绝大多数已被认为具有肿瘤抑制基因的作用。ＴＡＺ是一个转录激活 因子，是Ｙｏｒｋｉｅ在哺乳动物中的同源蛋白之一，我们的研究首次证明了ＴＡＺ是 哺乳动物细胞中ＨｉｐｐｏＰａｔｈｗａｙ的下游作用因子。我们的研究发现ＴＡＺ具有四个 保守的ＨＸＲＸＸＳ基序。Ｌａｔｓ２是果蝇Ｗｔｓ的同源蛋白，通过磷酸化该基序中的 丝氨酸，形成１４．３．３蛋白的结合位点，从而将ＴＡＺ限定在细胞质中。破坏这一 磷酸化作用将使ＴＡＺ处于持续激活的状态，进入细胞核激活下游基因的转录最 终刺激细胞增殖，诱导ＥＭＴ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）并促进细胞迁 移。我们的研究还证明了ＴＥＡＤ家族是介导ＴＡＺ功能的关键转录因子。我们在 ＴＡＺ的序列中发现了影响与ＴＥＡＤ结合的关键位点，突变该位点将破坏两者的 结合或者将ＴＥＡＤ沉默都能抑制ＴＡＺ刺激细胞增殖、诱使ＥＭＴ和促进细胞迁 移的癌变转化功能。我们的发现建立了ＴＡＺ与Ｈｉｐｐｏｐａｔｈｗａｙ的联系，对于阐明 ＨｉｐｐｏＰａｔｈｗａｙ在哺乳动物细胞中的生理功能和ＴＡＺ、ＴＥＡＤ在肿瘤发生和癌症 发展中的作用具有重要意义。 关键词 ＨｉｐｐｏＰａｔｈｗａｙ，ＴＡＺ，ＴＥＡＤ，磷酸化，１４—３－３，细胞增殖，ＥＭＴ，细胞迁移 复旦大学博士毕业论文 Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ＨｉｐｐｏＰａｔｈｗａｙ ｗａｓｆｉｒｓｔｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓａｎｏｖｅｌｏｒｇａｎｓｉｚｅｃｏｎｔｒｏｌ ａｐｐａｒａｔｕｓｄｕｒｉｎｇＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｂｙ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｓａｋｉｎａｓｅ ｃａｓｃａｄｅ．ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ Ｙｏｒｋｉｅ．ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｓｉｔｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｎｄｅｎｎｅｃｅｌｌｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｏｒｇａｎｓｉｚｅ．Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｐｐｏｐａｔｈｗａｙ ｌｅａｄｓｔｏ ｏｒｇａｎｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｇｒｏｗｔｈ．Ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，ｔｈｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ Ｈｉｐｐｏｐａｔｈｗａｙ ａｒｅｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄ；ｍｏｓｔ ｏｆｔｈｅｍｈａｖｅｂｅｅｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄａｓｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅｓ ｗｈｉｃｈｏｆｔｅｎｆｏｕｎｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｒｌｏｓｓｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅ． ＴＡＺｉｓａｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＣＯ．ａｃｔｉｖａｔｏｒｏｎｅｏｆＹｏｒｋｉｅｏｒｔｈｏｌｏｇｓ ｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌ． ＯｕｒｓｔｕｄｙｈａｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔＴＡＺｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｓｔｈｅｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｆａｃｔｏｒｏｆ Ｈｉｐｐｏｐａｔｈｗａｙ．Ｗｂ ｆｏｕｎｄｆｏｕｒｃｏｎｓｅｒｖｅｄＨⅪ阳ⅨＳｍｏｔｉｆｉｎＴＡＺ；Ｌａｔｓ２，ａ ｋｉｎａｓｅ ｈｏｍｏｌｏｇ ｏｆＷｔｓｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ ｔｈｅｓｅｒｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅｏｆｔｈｅ ｍｏｔｉｆａｎｄｃｒｅａｔｅｓａ１４．３－３ ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓ．ｗｈｉｃｈｒｅｓｕｌｔｓｉｎＴＡＺ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｌｅａｄｓｔｏｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＴＡＺ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｒ ｉｍｐｏｒｔ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｌｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ 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或其它器官处于一种动态稳定的平衡当中［３】。在某些情况下，如果器官受到损 坏，重建后仍然会形成一个与之前体积基本相当的新器官，仿佛这些器官具有某 种记忆功能，比如为了应对有毒食物对肝脏的破坏作用，进化使肝脏具有了强大 的再生功ｆｌ皂［４】。问题是这些器官是如何感受甚至说“意识”到这一体积上的变 化还有体积上的限定的。而在发育过程中，影响器官和个体大小的因素除了外界 的环境条件，如营养丰度等，主要是生物体自身固有的由遗传信息控制的一系列 生理过程诸如细胞生长，细胞增殖，细胞存活和细胞凋亡所综合作用的结果。研 究者们普遍认为，诸如营养丰度或是生长激素水平只能在整体上影响个体的大 小，而构成的器官的大小比例问题还在于细胞本身所具有的某种控制机制【３］。 显然，对于这一神秘却根本的调控机制的研究非常必要，因为它有可能解答一个 困扰人们多年的重大生物学问题，而且对最终阐明器官发育和癌症的发生发展具 有重要的意义。因为肿瘤的发生和癌症的发展显然是由于个体对组织器官中细胞 的限定失效导致的，是包括细胞增殖能力增强，细胞凋亡被抑制等多种过程联合 作用的结果，而近年来在模式生物果蝇中新发现的ＨｉｐｐｏＰａｔｈｗａｙ，不仅参与器 官尺寸的发育调控作用，它的缺损或者破坏都会导致细胞增殖能力增强，同时凋 亡作用被抑制的后果，不仅会造成突变体发育出体积庞大的器官，在几乎所有组 织中都会导致肿瘤样的剧烈增殖［１，２】。所以，对ＨｉｐｐｏＰａｔｈｗａｙ的进一步研究， 特别是对哺乳动物细胞中ＨｉｐｐｏＰａｔｈｗａｙ的生理功能和调控机制的研究具有非常 重要的意义。 １．ＨｉｐｐｏＰａｔｈｗａｙ的发现 癌症（Ｃａｎｃｅｒｏｒ Ｍａｌｉｇｎａｎｔｎｅｏｐｌａｓｍ）是当今人类面临的最重大医学问题。癌 症的发生源于发生基因突变的细胞不受控制的恶性增殖和往往与之伴随的迁移 复旦大学博士毕业论文 （ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）和侵袭（ｉｎｖａｓｉｏｎ）。原癌基因（ｐｒｏｔｏ．ｏｎｃｏｇｅｎｅ）获得功能的突变 （Ｇａｉｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）成为癌基因（ｏｎｃｏｇｅｎｅ），或是肿瘤抑制基因（ｔｔｔｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅ）发生丧失功能的突变（Ｌｏｓｓ ｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）都能使正常细 胞转化为具有恶性增殖特性的癌细胞［５．８】。癌基因包括编码生长因子，生长因子 受体，信号转导通路中的激酶和转录因子等众多基因，它们的结构变异、异常扩 增或高表达能使细胞脱离外界调控因子的依赖，逃避细胞凋亡并且能够无限增殖 ［７】。肿瘤抑制基因则编码参与ＤＮＡ损伤的检测和修复，细胞周期检查点的检测 调控，细胞凋亡，蛋白质泛素化降解等过程的蛋白质，当细胞中某个肿瘤抑制基 因的两份拷贝同时缺失或是失活时，细胞就具有转化为肿瘤细胞的潜能【８】。果 蝇作为模式生物在大规模遗传筛选肿瘤抑制基因中具有优良的特性，通过人工诱 变及果蝇生长发育过程中发生的有丝分裂重组（ｍｉｔｏｔｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ），一个母 细胞在有丝分裂后会得到一个纯和的基因缺失／突变型子细胞和伴生的一个纯和 的野生型子细胞，在后续的发育生长过程中比较突变型克隆和野生型克隆的生长 发育情况就能筛选出潜在的肿瘤抑制基因突变体，进而克隆出新的就有具有肿瘤 抑制作用的新基因；在ＦＬＰ／ＦＲＴ（ＦＬＰ：Ｆｌｉｐｐａｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ， ＦＲＴ： Ｆｌｉｐｐａｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ）重组系统应用后，果蝇遗传嵌合体（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｓａｉｃ）的筛选更加便利，成为筛选和发现新的肿瘤抑制基因的强大工具【９】。１９９５ 年，Ｘｕ，Ｔ．，ＧＭ．Ｒｕｂｉｎ研究小组和Ｊｕｓｔｉｃｅ，Ｒ．Ｗ．研究小组利用遗传嵌合体筛选 技术同时发现了一个新的肿瘤抑制基因，分别命名为Ｌａｔｓ（Ｌａｒｇｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ）和Ｗａｒｔｓ［１０，１１］。对克隆出的Ｌａｔｓ／Ｗｔｓ序列的分析发现Ｌａｔｓ／Ｗｔｓ可能编码 一个丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（ｐｒｏｔｅｉｎ．ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ），并且与酵母中的 Ｄｂｆ２，Ｄｂｆ２０丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶存在相似性，而这两个蛋白激酶在酵母的 细胞周期调控和细胞增殖过程中发挥作用。Ｌａｔｓ／Ｗｔｓ的纯和突变在果蝇胚胎发育 过程的整个阶段都具致死性，在成虫发育过程中，Ｌａｔｓ／Ｗｔｓ纯和突变在多个器官 和组织中都能引起剧烈的细胞增殖，但同时却并不影响这些细胞的发育方向，由 此推测Ｌａｔｓ／Ｗｔｓ可能具有调控器官尺寸大小的功ｆｌ邑［１０，１１】。２０星空体育登录入口 星空体育在线官网０２年，Ｋａｎｇｏ—Ｓｉｎｇｈ， Ｍ．等人发现了一个新的具有与Ｌａｔｓ／Ｗｔｓ相似突变表型的基因，并命名为Ｓｈａｒ－ｐｅｉ （ｓｈｒｐ）一由于突变个体头部表皮过度增殖形成扭曲皱褶的形态因此研究者以沙 皮宠物狗的名字命名，与此同时Ｔａｐｏｎ，Ｎ．等人发现同样的基因突变，并将该基 因命名为Ｓａｌｖａｄｏｒ（Ｓａｖ），Ｓａｖ／Ｓｈｒｐ是人类ｈＷＷ４５蛋白的同源蛋白，ｈＷＷ４５ 含有ＷＷ结构域［１２】，是蛋白质．蛋白质相互作用的重要结构域之一，首先在ＹＡＰ （Ｙｅｓ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ或ＷＷ６５）中被发现ｆ１３】，能够结合相互作用蛋白序列 中的ＰＰｘＹ等基序口代表脯氨酸Ｐｒｏｌｉｎｅ，Ｙ代表酪氨酸Ｔｙｒｏｓｉｎｅ，Ｘ代表任意氨 基酸），研究发现Ｓａｖ与Ｌａｔｓ／Ｗｔｓ存在相互作用，这一相互作用正是通过Ｓａｖ上 复旦大学博士毕业论文 的ＷＷ结构域与Ｌａｔｓ／Ｗｔｓ上的ＰＰｘＹ基序结合完成的，加上突变后表型模拟 （ｐｈｅｎｏｃｏｐｙ）ｌａｔｓ的突变，由此推测Ｓａｖ可能和Ｌａｔｓ处于同一个通路（Ｐａｔｈｗａｙ） 当中。Ｓａｖ的突变克隆细胞中检测到促进细胞增殖的细胞周期蛋白ＣｙｃｌｉｎＥ和细 胞凋亡抑制蛋白Ｄｉａｐｌ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆＡｐｏｐｔｏｓｉｓ １）ｒｎＲＮＡ含量增高，因 此推断突变体呈现出剧烈组织增殖的现象是刺激细胞增殖和抑制细胞凋亡共同 作用的结果；有趣的是研究者们还在多个人类肿瘤细胞系中发现ｈＷＷ４５蛋白存 在突变或者缺失［１４，１５］。２００３年，ＤｕｏｊｉａＰａｎ研究小组中的ＳｈｉａｎＷ．ｕ等人又发 现了具有相似突变表型的基因，因该基因的突变造成突变体呈现剧烈增殖的表型 而被命名为ｈｉｐｐｏ，ｈｐｏ（即河马——蚵ｐｐｏ，Ｈｉｐｐｏｐｏｔａｍｕｓａｍｐｈｉｂｉｕｓ），该突变体 也表现出类似的表型，如扩大的复眼（含有多余的未凋亡的间眼细胞． ｉｎｔｅｒｏｍｍａｔｉｄｉａｌｃｅｌｌｓ），皱褶的头部表皮（ｈｅａｄ ｃｕｔｉｃｌｅ），扩大的翅膀（ｗｉｎｇ），背 板（ｎｏｔｕｍ）上形成肿瘤样生长等，但并不影响这些细胞的发育方向。ｈｉｐｐｏ突变 体克隆细胞中同样检测到细胞周期蛋白Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ和对细胞凋亡起抑制作用的 Ｄｉａｐｌ的含量增高，并且通过精巧设计的转录报告系统确定了ＣｙｃｌｉｎＥ和Ｄｉａｐｌ 蛋白含量的增高是因为编码基因的转录被异常激活引起的。克隆出的ｈｉｐｐｏ基因， 通过序列比对确定是一个丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，属于Ｓｔｅｒｉｌｅ．２０蛋白激酶家族， 是人ＭＳＴｌ和ＭＳＴ２（ＭＳＴ： ＭａｍｍａｌｉａｎＳｔｅｒｉｌｅ Ｔｗｅｎｔｙ）的同源蛋白，催化结 构域（ＣａｔａｌｙｔｉｃＤｏｍａｉｎ）分别有５８％和６０％的氨基酸序列完全相同，将ＭＳＴ２ 表达在Ｈｐｏ突变体中能够完全逆转组织剧烈增殖的表型。由于Ｈｐｏ，Ｓａｙ和 Ｌａｔｓ／Ｗｔｓ具有相似的突变表型，和相似的通过激活ＣｙｃｌｉｎＥ和Ｄｉａｐｌ．的转录从而 同时促进细胞增殖抑制细胞凋亡的作用，因此推断Ｈｐｏ，Ｓａｖ和Ｌａｔｓ／Ｗｔｓ可能处 于同一个信号通路当中。研究者首先发现了Ｈｉｐｐｏ和Ｓａｖ存在相互作用，在酵母 双杂交（ＹｅａｓｔＴｗｏ Ｈｙｂｒｉｄ）实验当中，Ｈｉｐｐｏ非催化的Ｃ端肽段与Ｓａｖ的Ｃ端 含有ｗｗ结构域和Ｃｏｉｌｅｄ．Ｃｏｉｌ结构域的肽段存在相互作用。这一结果又在 ＧＳＴ－Ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ和免疫共沉淀（ＣＯ．ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）中得到了证实。后续的生 化分析和遗传学实验都表明Ｈｉｐｐｏ在体外和体内都是Ｓａｖ的磷酸化激酶。最重要 的发现是Ｈｉｐｐｏ／Ｓａｙ能够使Ｌａｔｓ／Ｗｔｓ磷酸化，Ｈｉｐｐｏ在Ｓａｖ的作用下磷酸化蛋 白激酶Ｌａｔｓ。这一过程是Ｈｉｐｐｏ磷酸化Ｓａｙ并通过结合Ｃｏｉｌｅｄ．Ｃｏｉｌ结构域与Ｓａｖ 形成复合体，Ｓａｖ通过ＷＷ结构域结合Ｌａｔｓ，将Ｈｉｐｐｏ与Ｌａｔｓ联系起来，然后 Ｈｉｐｐｏ磷酸化Ｌａｔｓ——由此，一个新的信号通路被发现了，通过两个级联的蛋白 激酶Ｈｉｐｐｏ和Ｌａｔｓ的作用，将抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的调控结合起来， 控制细胞数量限定器官尺寸的大小，而该信号通路也被命名为Ｈｉｐｐｏ或ＳＷＨ（即 Ｓａｌｖａｄｏｒ－Ｗａｒｔｓ．Ｈｉｐｐｏ）信号通路【１６］。这一结论也得到了同时期其他研究者的研 究证实［１７．１９］。２００５年，Ｌａｉ，Ｚ．Ｃ．等人又发现了一个相似的自发突变体，通过克 复且大学博：｛ｊ毕业论文 隆确定产生该突变表型的基因属于Ｍｏｂ蛋白超家族（Ｍｏｂ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙｐｒｏｔｅｉｎ， Ｕｐｓｔｒｅｌ ｍ ｓｉｇｎａｌ 丫Ｓａｖ Ｈｉｐｐ。＋－ｓｅｒｒｒＰｒ≯ｏｔ ｎ ≥ｌ ｐ◆Ｍａｔｓ Ｌａｔｓ＋－ｓｅ船引ｎ 和＾Ｐ？ ＡＤＰ Ｃｏｕｐｌｅ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓ，ＣｙｃＥ，ＤＪ『ａｐｌ，ｍｉＲｂａｎｔａｍ，ｅｔｃ． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｈｉｐｐｏ（Ｈｐｏ） ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｒ江ｈｒｋｉｎａｓｅ Ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｄｕｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ Ｓａｌｖａｄｏｒ（Ｓａｖ） Ａｄａｐｔｏｒ Ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｄｕｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ Ｌａｔｓ ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｒ疆ｈｒｋｉｎａｓｅ Ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｄｕｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ Ｍａｔｓ Ａｄａｐｔｏｒ Ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｄｕｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ＹｏｒｋｉｅⅣｌ‘ｉ） ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＣＯ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ Ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ 图１．１ＨｉｐｐｏＰａｔｈｗａｙ的发现过程｜９。２２ Ｍｏｂ： Ｍａｐｓ ｏｎｅ ｂｉｎｄｅｒ），由于具有肿瘤抑制基因的功能，因此命名为Ｍａｔｓ，即 Ｍｏｂａｓｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ。Ｍａｔｓ的突变同样导致突变体呈现多种组织器官的剧烈 增殖，这一现象同样也是由促进细胞增殖的细胞周期蛋白ＣｙｃｌｉｎＥ和抑制细胞凋 亡的Ｄｉａｐｌ蛋白含量增高导致的，并且调控是发生在转录水平上的。Ｍａｔｓ的人 同源蛋白ＭＡＴＳ１（又名Ｍｏｂｌ Ａ或ＭＯＢＫＬ１ Ｂ－－ｍｐｓ ｏｎｅｂｉｎｄｅｒｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖａｔｏｒ．１ｉｋｅ １Ｂ），与Ｍａｔｓ的氨基酸序列对比有高达８７％的位点相同。并且将人的ＭＡＴＳｌ在 果蝇Ｍａｔｓ突变体中表达能够拯救因Ｍａｔｓ功能确实导致的多组织剧烈增生。而 Ｍａｔｓｌ在多种人及小鼠的肿瘤细胞中存在缺失或者丧失功能的突变，进一步证实 了Ｍａｔｓ作为肿瘤抑制基因的保守性。研究发现Ｍａｔｓ能够激活Ｌａｔｓ的激酶活性。 在有Ｍａｔｓ存在的情况下，Ｌａｔｓ能够磷酸化自身和Ｍａｔｓ并且形成Ｌａｔｓ／Ｍａｔｓ复合 物，这一过程对激活Ｌａｔｓ的激酶活性非常重要［２０１。另外，人的ＬＡＴＳｌ，ＭＳＴ２ 复旦大学博士毕业论文 和ＭＡＴＳｌ都可以功能替换果蝇的同源蛋白Ｌａｔｓ，Ｈｉｐｐｏ和Ｍａｔｓ，这也证明这一 调控机制在进化中的保守性［１６，２０，２１］。为了进一步探索Ｈｉｐｐｏ信号通路的下游 组成，Ｄｕｏｊｉａ Ｐａｎ研究小组中的ＪｉａｎｂｉｎＨｕａｎｇ等人利用酵母双杂交系统，以Ｌａｔｓ 的Ｎ端非催化活性片段（ｎｏｎｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌｐｏｒｔｉｏｎ）为诱饵（Ｂａｉｔ），发现了 一个与Ｌａｔｓ结合的蛋白，并且在后续的免疫共沉淀实验中得到了验证。该蛋白 是人ＹＡＰ（Ｙｅｓ．ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎ，由于序列中含有两个ＷＷ结构域因此又名 ＷＷ６５，ＹＡＰ的分子量为６５Ｋｄ）的同源蛋白，由于已知ＹＡＰ是一个转录调控因 子（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＲｅｇｕｌａｔｏｒ），因此推测该蛋白也具有转录调节的功能。该蛋白功 能丧失的突变造成突变个体组织器官尺寸下降，因此研究人员用世界上体型最小 的宠物狗——约克夏（ＹｏｒｋｓｈｉｒｅＴｅｒｒｉｅｒｓ）的名字命名该基因为Ｙｏｒｋｉｅ。Ｙｏｒｋｉｅ 和ＹＡＰ有３１％的氨基酸序列相同，在结构域组成上同样含有两个ＷＷ结构域， ＷＷ结构域可以与底物上的ＰＰｘＹ蛋白结合，已知Ｌａｔｓ上就含有ＰＰｘＹ继续，并 且该基序是同样含有ＷＷ结构域的Ｓａｌｖａｄｏｒ即ＷＷ４５的结合序列。研究者证明 Ｙｏｒｋｉｅ正是通过含有ＷＷ结构域的肽段与Ｌａｔｓ结合的。Ｙｏｒｋｉｅ的过表达 （ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）导致细胞增殖加快的同时抑制细胞的凋亡，这些现象与同时检 测到的细胞周期蛋白ＣｙｃｌｉｎＥ和细胞凋亡抑制因子Ｄｉａｐｌ的ｍＲＮＡ含量升高有 关，所有这些结果与Ｈｉｐｐｏ，Ｓａｖ，Ｌａｔｓ和Ｍａｔｓ突变后所呈现的结果一致。Ｙｏｒｋｉｅ 的纯和缺失导致果蝇发育的胚胎致死，利用ＦＬＰ／ＦＲＴ系统在果蝇的复眼发育过 程中引入有丝分裂重组，Ｙｏｒｋｉｅ的纯和缺失将导致复眼尺寸大幅度减小，因此 Ｙｏｒｋｉｅ是果蝇正常发育的必需因子。研究证明ＣｙｃｌｉｎＥ和Ｄｉａｐｌ的转录增高与 Ｙｏｒｋｉｅ的存在相关。体外的激酶检测（ｉｎｖｉｔｒｏ ｌ【ｉｎａｓｅ ａｓｓａｙ）和磷酸酯酶 （Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）处理都表明Ｈｉｐｐｏ信号通路通过Ｈｉｐｐｏ／Ｓａｖ＞Ｌａｔｓ／Ｍａｔｓ＞Ｙｏｒｋｉｅ的 方向磷酸化Ｙｏｒｋｉｅ，并且磷酸化的程度（在ＳＤＳ．ＰＡＧＥ和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验中磷 酸化表现为Ｙｏｒｋｉｅ条带的迁移滞后——Ｒｅｔａｒｄａｎｔｍｏｂｉｌｉｔｙｓｈｉｆｔ）与Ｈｉｐｐｏ信号通 路的完整度成正比，即上游激酶Ｈｉｐｐｏ，辅助蛋白（ｓｃａｆｆｏｌｄｓｕｂｕｎｉｔｓ）Ｓａｖ和Ｍａｔｓ 都能增强Ｌａｔｓ磷酸化Ｙｏｒｋｉｅ的程度，同时也暗示Ｌａｔｓ多磷酸化Ｙｏｒｋｉｅ。这一体 外实验同样得到了果蝇的遗传相互作用（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）实验的证实［２２１。因 此，新发现的信号通路ＨｉｐｐｏＰａｔｈｗａｙ进一步完整地呈现出来，由两个级联的丝 氨酸／苏氨酸蛋白激酶构成核－ｔ二 （Ｃｏｒｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔ），分别在辅助蛋白Ｓａｖ和Ｍａｔｓ 的协助下磷酸化转录调节因子Ｙｏｒｋｉｅ，并拮抗（ａｎｔａｇｏｎｉｓｅ）其对细胞增殖（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ），细胞存活（ＣｅｌｌＳｕｒｖｉｖｅ）和细胞凋亡（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）的影响，从而达 到整合控制（Ｃｏｕｐｌｅ，Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ，Ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅ）发育中构成器官的细胞数量并 最终限定器官尺寸大小的作用。 自然下一步的工作一方面就是根据已发现的事实进一步探索这一信号通路 复旦大学博士毕业论文 上游的调控机制（ＵｐｓｔｒｅａｍＲｅｇｕｌａｔｏｒｓ）和下游的效应机制（Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｅｆｆｅｃｔｏｒｓ）， 另一方面，则是探索Ｈｉｐｐｏ信号通路在哺乳动物细胞中的组成和功能。影响器官 和个体大小的因素除了外界的环境条件，如营养丰度等，主要是生物体自身固有 的由遗传信息控制的一系列生理过程诸如细胞生长，细胞增殖，细胞存活和细胞 凋亡综合作用的结果【３】。由于器官尺寸调节（ＯｒｇａｎＳｉｚｅ）是多细胞生物的发育 生长的根本机制，因此在人体细胞中，无论从组成还是调控机制上都应该具有较 高的保守性【１．３】。 Ｈｉｐｐｏ在哺乳动物细胞中有两个同源蛋白ＭＳＴｌ和ＭＳＴ２１１６，２３，２４］，其中 ＭＳＴ２在催化结构域和Ｈｉｐｐｏ有更高的保守性［１６】。ＭＳＴｌ和ＭＳＴ２首先被发现 是出芽酵母（ＢｕｄｄｉｎｇＹｅａｓｔ）中Ｓｔｅｒｉｌｅ２０的同源蛋白，并因此而被命名为 ＭａｍｍａｌｉａｎＳｔｅｒｉｌｅ Ｔｗｅｎｔｙ，ＭＳＴ［２３，２４］。Ｓｔｅｒｉｌｅ２０在出芽酵母中起到ＭＡＰ４Ｋ 的作用，在配对（Ｍａｔｅ）过程中执行功能。ＭＳＴｌ虽然与Ｓｔｅｒｉｌｅ２０存在同源性， 但是ＭＳＴｌ不能拯救Ｓｔｅｒｉｌｅ２０缺失的表型，说明ＭＳＴｌ和Ｓｔｅｒｉｌｅ２０执行不同的 功能。研究发现ＭＳＴｌ在Ｆａｓ诱导的细胞凋亡中被Ｃａｓｐａｓｅ ３裂解，产生的没有 Ｃ端调控序列的片段具有进一步激活细胞凋亡的作用［２５】。后来发现被Ｃ唧ａｓｅ－３ 切割后的ＭＳＴｌ能够磷酸化组蛋白Ｈ２Ｂ的Ｓ１４位点，促进细胞凋亡过程的进行。 另外还发现ＭＳＴｌ能够磷酸化ＦＯＸＯ，在氧化应激（ＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓ）反应中， ＭＳＴｌ磷酸化ＦＯＸＯ的Ｆｏｒｋｈｅａｄ结构域中的保守序列，破坏ＦＯＸＯ与１４－３－３蛋 白的结合，ＦＯＸＯ进入细胞核启动细胞凋亡的程序，该机制的破坏将导致老化加 剧和寿命的缩短［２６】。另外，ＲＡＳＳＦｌＡ也能与ＭＳＴｌ相互作用，并且能促进Ｆａｓ 诱导的细胞凋亡中ＭＳＴｌ的激酶活性，促进细胞凋亡的过程［２７］。早先发现Ｈｉｐｐｏ， Ｓａｖ的相互作用序列和Ｒａｓｓｆ有同源性，因此提出了一个新的结构域ＳＡＲＡＨ （Ｓａｖ．Ｒａｓｓｆ－Ｈ 【】。这一发现证明了三者可以通过彼此间的 结 构 ＿ ｉ ｐ ｐ ｏ ） ２ ８ ＳＡＲＡＨ 域相互作用。已发现ＲＡＳＳＦｌＡ、ＭＳＴｌ和ＭＳＴ２在软组织肉瘤中存在高频率的 表观遗传学修饰抑制作用（Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ），三个基因的启动子都存在被 甲基化（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）修饰的现象，提示这三个促进细胞凋亡的基因与肿瘤的发 生存在很高的相关性［２９］。 Ｓａｌｖａｄｏｒ在人体细胞中的同源蛋白是ｈＷＷ４５／ＳＡＶ。ｈＷＷ４５／ＳＡＶ最先在筛选