PCR异常扩增曲线分析 PCR异常扩增曲线分析 在PCR实验中，随着扩增产物的不断累积，荧光信号也不断增加，每个循环都采集一次荧光信号。经过一定的循环数后，比如40个循环，就可以得到扩增曲线图。基线是指在PCR扩增反应最初的几个循环里荧光信号变化不大的直线个循环的荧光信号作为荧光本底信号，阈值的设定是3-15个循环荧光信号标准差的10倍，在PCR扩增的指数期设定。CT值是扩增产物的荧光信号到达设定的阈值线时所经历的扩增循环数，即扩增曲线和阈值线的交汇处的横坐标所显示的值。 标准曲线可以用来确定未知样品的初始量。每个模板的CT值与该模板的起始的拷贝数的对数是存在线性关系的，起始的拷贝数越大，CT值就越小。标准品按照一定的倍数稀释5-6个浓度左右，根据RT-PCR的反应条件进行反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，CT值为纵坐标，绘制线性曲线。未知样品的拷贝数可根据曲线方程计算得来。标准曲线的标准品需要是准确定量的、标准化的、稳定的质粒DNA，5-6个稀释梯度，PCR反应仪器和反应条件一致。 溶解曲线是考察染料标记法结果的特异性，分分钟确定引物是否有效。 在PCR实验中，正确的判断扩增曲线是非常重要的。如果反应产物单一，则曲线会出现一个尖峰；如果有二聚体或非特异性扩增，则会出现至少两个峰或更多。使用SYBR Green染料时，必须进行溶解曲线分析，因为这是一个非特异性染料。 在实验中，常见的问题包括：（1）扩增曲线个循环后没有平台期？或者扩增曲线根本无法呈现指数上升？这种情况很可能是因为起始模板浓度太低了，可以通过增加循环数来验证是否是该问题。（2）溶解曲线的问题，如多个峰、尖峰前面有小峰或没有峰？这与引物和反应体系温度有关。如果没有峰或杂乱无章，很可能是引物的问题，建议重新设计引物。有时有小的峰，可以通过优化反应条件，如退火温度的优化来消除影响。 常见的异常曲线）确认软件设置是否正确，检查时间、温度、循环数、荧光采集等是否设置正确，注意所选用的试剂中是否含有ROX作为参比荧光染料。（2）确定耗材及仪器配件是否使用正确，如错误使用普通PCR耗材、未选择跟仪器加热模块规格匹配的耗材、使用质量较差的耗材等。耗材对于荧光定量PCR来说非常重要，很多异常的扩增曲线是由于耗材使用不当引起的。 目前市场上有许多种荧光定量PCR耗材，但质量良莠不齐。因此，在选择耗材时，应尽可能选择质量和品牌都较好的，以避免引起一系列问题，并避免不必要的浪费。例如，质量不好的耗材可能会导致荧光值不稳定，从而造成反应孔的自动基线扣除错误，得到不准确的CT值。因此，更换质量好的耗材后，荧光信号会恢复正常。 如果使用的PCR反应板封膜质量不好，在PCR过程中受到水蒸气的影响，容易产生变形。这可能会导致“光学扭曲”现象，但在使用ROX作为参比染料时，ROX可以有效校正这种荧光信号的变化，使扩增图结果正常。 除了耗材外，与仪器配套使用的配件也需要检查是否正确使用。例如，配套的8联管托架在使用时只需使用下半部分，如果忘记取下上半部分，可能会影响扩增。 如果设置、耗材和配件都没有问题，但扩增曲线仍然异常，需要确定所用试剂是否正常。首先，要确定试剂是否有效，包括检查试剂是否在有效期内，是否反复冻融多星空体育 星空体育平台次，以及运输条件是否正常。可以通过比较试剂的批次号和实验中的阳性对照结果来确定试剂的有效性。其次，要观察扩增完的试剂体积，如果在扩增过程中有试剂星空体育 星空体育平台蒸发，可能会导致扩增曲线抬升现象。如果实验体系中加入了ROX作为参比荧光，ROX荧光可以区分扩增曲线抬升是真扩增还是蒸发。 如果试剂蒸发，水分丢失，ROX浓度会增加，ROX参比荧光会上抬，而正常孔中ROX荧光会一直不变。因此，在加完试剂上机
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