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本发明专利技术公开了一种高效扩增NK细胞的方法，具体是一种使用高表达膜蛋白CD19、CD137L、CD86、CD64及跨膜蛋白IL‑21的K562工程细胞联合人IL‑2突变体高效扩增NK细胞的方法。本发明专利技术方法操作简单，成本低，获得的NK细胞数量大、纯度高、杀伤效果好，适合NK细胞的大规模制备，为NK细胞过继性免疫治疗应用于临床打下了良好的基础。
自然杀伤细胞(NaturalKillercell，NKcell)是T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，是人体免疫系统的第一道防线，在机体抗病毒感染和抗肿瘤免疫中起重要作用。NK细胞识别靶细胞无MHC限制性，可以在无预先致敏的情况下杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞。同时，还可以产生一系列的细胞因子进而对机体的获得性免疫进行调节，是连接机体固有免疫和特异性免疫的桥梁。NK细胞由于具有直接杀伤活性和免疫调节活性，而一度成为免疫细胞过继疗法的新热点。此外，还有越来越多的报道将原代NK细胞或NK细胞系进行基因改造以提高其杀伤肿瘤细胞的特异性和活性，进而进行过继免疫治疗，在动物实验和临床试验中均取得了良好的效果。可见，NK细胞在肿瘤的生物治疗中具有广阔的应用前景。NK细胞的杀伤功能及疗效与其数量直接相关，然而NK细胞在外周血中比例小，约占外周血PBMC的5％～10％，传统的使用的野生型IL-2扩增NK细胞的方案，不仅NK扩增倍数有限，端粒酶活性降低，而且扩增后NK细胞的各种活化受体或CD16分子表达丢失导致NK细胞毒性减弱；最近的研究发现，野生型IL-2还可以扩增Treg细胞，而Treg细胞能够显著抑制NK细胞的杀伤作用，从而影响NK细胞的临床疗效。尽管国外已有商品化的NK细胞分离试剂盒，利用这些试剂，通过FACS分选或MACS法纯化可获得90％以上纯度的NK细胞。但操作复杂，费用昂贵，且高度纯化的NK细胞不能在体外大量扩增，难以满足临床试验的需求。之前有文献报道，采用K562细胞转染跨膜IL-21和CD137复合体与体外PBMC共培养扩增NK细胞，使得NK细胞数量、纯度和活性显著增强。然而，肿瘤微环境是一个复杂的综合系统，在肿瘤微环境中存在有大量的肿瘤相关巨噬细胞和CD19+B细胞，这些细胞为肿瘤细胞的生长提供营养因子。用仅转染跨膜IL-21和CD137复合体的K562细胞激活扩增NK细胞虽然对肿瘤细胞有很强的杀伤能力，但是对肿瘤微环境中的肿瘤细胞相关巨噬细胞和B细胞的杀伤能力却很弱。
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用人IL-2突变体联合K562细胞高效扩增NK细胞的方法。该方法操作简单，扩增的NK细胞具有纯度高、数量大、杀伤活性好等优点，适合于NK细胞大规模制备，为NK细胞过继性免疫治疗应用于临床打下了良好的基础。本专利技术的一种利用人IL-2突变体联合K562细胞高效扩增NK细胞的方法，包括：(1)使用慢病毒转染系统将CD8α-白介素21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的基因同时转染K562细胞；载体中含有病毒启动子和选择标记基因；(2)当外源表达载体进入宿主细胞后，激活启动子，体外培养K562细胞一段时间后，经流式细胞术分选，获得稳定表达跨膜蛋白CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562工程细胞；(3)将稳定表达CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562工程细胞经过γ射线照射灭活，作为NK细胞的滋养细胞；(4)分离并提取外周血单个核细胞(即PBMC)并计数，按一定的比例(K562:PBMC)加入灭活的K562滋养细胞，在IL-2突变体协同作用下，与PBMC共培养2～3周，即可得到纯度较高的NK细胞。其中，步骤(1)所述的CD8α为在细胞膜上表达的膜蛋白，CD8α基因连接IL-21基因后使得IL-21表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白；而CD19、CD137L、CD86、和CD64为膜蛋白。步骤(2)所述的纯化后的K562工程细胞其跨膜CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的表达量在85％以上。步骤(3)所述的灭活K562工程细胞的γ射线突变体是通过对氨基酸定点替代，将其IL2α受体结合点突变，突变的位点在IL-2的37，38，41，42，43，44，45，61，62，65，68和72氨基酸位点。不仅能够其降低诱导调节性T细胞的功能，同时还保留了其对NK细胞的免疫活性，可用于刺激免疫系统，从而提高其临床疗效和应用范围。步骤(4)所述的PBMC重悬密度为1～2×106，白介素-2突变体的使用浓度为50～100ng/ml，加入K562滋养细胞与PBMC的比例为0.1：1～1：1，作为更佳选择，上述方法中K562:PBMC＝0.1:1或0.2:1。本专利技术的方法以稳定高表达膜蛋白CD19、CD137L、CD86、CD64及扩膜蛋白IL-21的K562工程细胞为滋养细胞，以白介素-2突变体为NK细胞扩增因子，以GT-T551培养基为基础星空体育官方入口 星空体育官网培养基，在添加适量自体血浆的条件下，体外培养2～3周，成功制备了纯度高、体外杀伤活性好的NK细胞，该NK细胞高表达激活受体NKG2D，同时低表达抑制性受体CD158α。本专利技术通过基因工程的方法，构建基因修饰的K562工程细胞，使其可以同时高表达膜蛋白CD19、CD64、CD86、CD137L和跨膜蛋白IL-21。将灭活的K562工程细胞在低浓度IL-2突变体存在的条件下与体外分离的外周血单个核细胞共培养，不仅可以高效地扩增人NK细胞，而且还可以增强NK细胞的杀伤功能。在K562细胞中转染CD19有助于激活NK细胞识别并杀伤肿瘤微环境中的B细胞；而CD137L为TNF超家族的新成员，与其配体结合后介导的共刺激信号，可促进T细胞和NK细胞增殖；转染CD86有助于提升NK细胞对肿瘤细胞、微环境中的肿瘤相关巨噬细胞和B细胞的杀伤作用；CD64分布于单核细胞、巨噬细胞及中性粒细胞表面，参与调理吞噬作用及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，转染CD64可以增强NK细胞的ADCC效应。而培养过程中使用的人白细胞介素II突变体是通过对氨基酸定点替代，将其IL-2α受体结合点突变，不仅能够其降低诱导调节性T细胞的功能，同时还保留了其对NK细胞的增殖活性，可用于刺激免疫系统，从而提高其临床疗效和应用范围。较传统方法制备的NK细胞，该方法具有操作简单，扩增的NK细胞具有纯度高、数量大、杀伤活性好等优点，适合于NK细胞大规模制备，为NK细胞过继性免疫治疗应用于临床打下了良好的基础。本专利技术采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：附图说明图1为实施例一中CD19、CD137L、CD86、IL-21在K562基因工程细胞中的表达情况；图2为实施例二中NK细胞体外扩增线性图，显示NK细胞在转染跨膜IL-21、CD19、CD137L、CD64和CD86的K562细胞与低剂量的IL-2突变体共同作用下线与低剂量的野生型IL-2扩增的NK细胞作为对照；图3为实施例二中在K562工程细胞和IL-2突变体共同作用下，体外培养21天时NK细胞的纯度，以该K562工程细胞与低剂量的传统IL-2扩增的NK细胞作为对照；图4为实施例二中在K562工程细胞和IL-2突变体共同作用下，体外培养21天时NK细胞表面Fc受体CD16的表达情况，以该K562工程细胞与低剂量的传统白介素-2扩增的NK细胞作为对照；图5为实施
一种高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括下列步骤：步骤一，将CD8α‑IL‑21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的基因利用外源表达载体转染K562细胞；步骤二，当外源表达载体进入宿主细胞后，激活启动子，体外培养K562细胞并分选获得稳定表达CD8α‑IL‑21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562工程细胞；步骤三，将步骤二获得的K562工程细胞经过γ射线滋养细胞；步骤四，分离并提取外周血单个核细胞，在IL‑2突变体协同作用下，将步骤三获得的K562滋养细胞与外周血单个核细胞共培养，获得NK细胞。
1.一种高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括下列步骤：步骤一，将CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的基因利用外源表达载体转染K562细胞；步骤二，当外源表达载体进入宿主细胞后，激活启动子，体外培养K562细胞并分选获得稳定表达CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562工程细胞；步骤三，将步骤二获得的K562工程细胞经过γ射线滋养细胞；步骤四，分离并提取外周血单个核细胞，在IL-2突变体协同作用下，将步骤三获得的K562滋养细胞与外周血单个核细胞共培养，获得NK细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中外源表达载体中含有病毒启动子和选择标记基因。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中K562工程细胞的CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD6...