10)向培养板中加入10μL不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物；
11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时(例如：6、12、24或48小时）（药物起作用);
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基)，去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
6)将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中,低速离心800rpm 3分钟,倒去上清液；
8）吸取20ul细胞悬液(10ul细胞悬液10ul台盼兰液:给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板,进行细胞计数；
9）在96孔板中，给每孔加100μL(约7000个)的细胞悬液,将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5％CO2），使细胞贴壁；
实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640)、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin—EDTA）、胎牛血清(FBS）、双抗］,所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下星空体育网站 星空体育首页看细胞生长状态，有无污染。
3)加入胰酶500ul/0。5ml2~10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）;
4）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1］中和胰酶；
测定待测定药物（6个浓度）对肺癌A549细胞增殖的影响,实验加样（最外围的36孔加PBS液，实际上可用60个孔）：
12）向每孔加入10μL（约10%）CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）;
15）若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1％ w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下24小时内测定,吸光度不会发生变化。