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[0002]该申请请求对下列美国临时专利的优先权:#61/621,271,2012-4-6提交;#61/550,667,2011-10-24提交;#61/510,539,2011-7-22提交;#61/490,790,2011-5-27提交;
[0004]该发明获NIH3R01HG005097-02和3R01HG005097-02S1经费支持。政府对该发明
[0005]本发明的实施方式通常涉及用于扩增基因组序列如单细胞全基因组扩增的方法与成分。
[0006]目前使用随机引物扩增DNA与RNA的一个常见问题是引物二聚体的形成。引物使用浓度需要足够高以取得有效扩增,高浓度引物导致二聚体的形成,明显降低引物与DNA或RNA模板的结合。使用随机引物扩增DNA的其它问题包括由于位点丢失而无法扩增基因组的全部,短小扩增物的生成,以及有时无法扩增部分降解或有人工修饰的
[0007]文献中已经有关于基因组PCR扩增方法的报道,例如US7,718,403,US2003/0108870和US7,402,(不均一性),导致扩增后部分位点丢失。这些方法扩增的细胞产物常常只能测序5-30%的基因组序列。多个置换扩增法(MDA)利用低温扩增,可导致嵌合物的大量形成,这些非基因组本来的序列造成明显的测序假阳性结果以及测序人工假象。虽然全基因组扩增已经有开始尝试,但一般说来这些方法低效,复杂,费用贵。因此,需要发展一种从很少DNA量,比如说单细胞,扩增全基因组的有效方法。
[0008]该专利涉及一种DNA扩增方法,该扩增方法使用少量基因组DNA,或少量基因组DNA序列,来自于人或其它物种的单细胞,或一种细胞的少数几个细胞,血液或体液。该扩增方法可以用单个反应管,在PCR扩增仪上进行扩增。该方法可用于由单细胞扩增的全基因组DNA的高通量测序,并取得相当的测序深度。
[0009]该专利方法对单细胞全基因组的各不同位点进行高保真,高均一,高测序广度的扩增,扩增物用于高通量测序分析。该方法减少了测序偏向,从而能从单细胞提供出比较全面的,90%以上,基因组DNA序列信息,在7x,IOx,或15x
的测序深度时,可以测得70%以上的基因组序列信息,并且基本没有嵌合物形成的影响。该方法避免了测序人工假象,推进了单个核苷酸多形性(SNP),基因拷贝数多形性(CNV),基因结构变化(SV)等高级基因组分析,及高通量基因测序分析。该方法特别有用于有多个细胞群体的生物系统,如肿瘤,神经组织等。
[0010]该专利方法所用弓丨物包含一段共同序列,一段可变序列,一段固定序列。DNA变性后单链的引物与单链模板在低温结合,然后在高温下扩增,使用至少一个具有链置换性能及3’端核酸核酸外切酶活性的聚合酶。在第二个扩增循环结束时,双链DNA(dsDNA),一端有引物的序列结合,另一端有互补引物序列结合,变性产生单链DNA(ssDNA)。反应温度降低到可以使游离引物与单链扩增物的3’端杂交的温度,从而防止扩增物自身或相互之间杂交,再降温到适当温度完成引物的结合与下一个扩增循环。
[0011]该专利方法可用于少量或微量DNA扩增,对样品DNA的多个部位进行核型分析或高通量筛选,可用于快速建立针对染色体特定区域的带特异性的探针,微解剖,或扩增未知染色体区域或已标记的异常染色体的标记染色体,用于扩增物的快速克隆或建立DNA库。因此该方法不仅对核型分析与高通量筛选有用,对细胞遗传诊断也有价值。
[0012]该专利方法使用非常规PCR循环扩增方法从单个哺乳动物细胞扩增全基因组序列。某些
DNA聚合酶能够产生典型的结果。可以增加一个扩增步骤让游离引物与扩增物上的互补序列结合,比如说3’端,从而防止扩增物自身或相互之间杂交,以至于嵌合物的形成,并提供了去除扩增物两端引物的方法。
[0013]该专利方法扩增一个或几个细胞的全基因组序列。在使用示意中,首先分离单细胞,将之在一定体积的细胞裂解液中裂解,释放基因组DNA,裂解产物可以分成2亚份到10万亚份不等。DNA分离方法可以将同源的两个基因位点分与不同的亚份中,亚份数越多,同源DNA位点分与不同亚份的可能性越高。同源DNA的两个位点分与不同亚份可以用于基因组DNA半倍体的核型分析。不同亚份中的基因组组份可以扩增得到相应部分的基因组扩增物,用于测序分析。两个或两个以上,相同的或不同细胞,的样品可以当作单细胞样品处理分析。
[0014]该专利方法扩增一个或几个细胞的全基因组序列。单细胞的遗传物质可以分成若干亚份,并分别进行扩增分析,从而实现单倍体或二倍体核型分析。该方法可用于没有参考基因组序列,或有复杂结构`变化的基因组的物种的全新基因组测序组装。该方法可采用不同来源的DNA,包括不均一组织,如肿瘤,罕见与珍贵样品,如胚胎干细胞,非分裂细胞,如神经元,等。也可以用于不同测序平台与核型分析方法。单倍体核型分析方法可参见下列文献
:Levy,,e254(2007);deBakker,-,1166-1172(2006);Nagel,-,1371-1375(1991);Drysdale,,10483-10488(2000);Sun,,7009-7017(2008);Kitzman,-,59-63(2011);,52-58(2010)
;Xiao,,199-201(2009);-,51-57(2011).[0015]该专利方法其它相关特性与优势在以下的描述中有更明确的阐述。
[0016]该专利上述方法及其它相关特性与优势在下列使用示意中得到明确的阐述。
[0020]图3:用于高通量测序的单细胞DNA扩增流程图,包括线性预扩增与指数扩增阶段。
[0021]图4:该专利方法,-多次退火环状循环扩增法(MALBAC)示意图。首先,引物与单链DNA模板结合,被具有链置换活性的聚合酶延伸,产生半扩增物。然后,产生两端有互补序列的单链完全扩增物,后者在中间温度,两端自连,从而在该步骤不能用作模板,而实现近线性扩增,避免了常见的扩增偏向。
[0022]图5A为Lorenz曲线,比较MALBAC,MDA,非扩增样品的测序广度的均一性。单细胞与非扩增样品来自于SW480细胞株。MDA方法的资料来自于Fanetal.,,5192011).完全均一无偏向的扩增在图中应当是一条对角线,与对星空体育官方入口 星空体育官网角线偏离越远代表扩增偏向越严重。箭头代表没有被扩增的基因组部分(MDA55%,MALBAC15%,未扩增样品5%)。图5B为全基因组读序分布图,MALBAC与未扩增样品结果相似,MDA方法则有大量的低密度区,代表了几个百万`碱基大小的区域在扩增物中被低估或高估。
[0023]该专利涉及到一般常规操作方法,如分子生物学技术,重组DNA技术,微生物学技术,在文献中已有很详细的描述。参见:Sambrook,Fritsch,andManiatis,MolecularCloning:AlaboratoryManual,2ndEdition(1989),Oligonucleotidesynthesis(,Ed.,1984),AnimalCellCulture(,Ed.,1987),MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc系列,GeneTransferVectorsforMammalianCells(,1987),HandbookofExperimentalImmunology(,Eds),CurrentProtocolsinMolecularBiology(.,1987),CurrentProtocolsinImmunology(.,1991),AnnualReviewofImmunology,AdvancesinImmuno1Igy.[0024]
核酸化学,生化,遗传,分子生物学的术语与符号,采用专业内标准用法。具体如KombergandBaker,DNAReplication,2ndEdition(,NY,1992);Lehninger,Biochemistry,2ndEdition(WorthPublishers,NY1975);StrachanandRead,HumanMolecularGenetics,2ndEdition(ffiley-Liss,NY,1999);Eckstein,editor,Oligonucleotidesandanalogs:ApracticalApproach(OxfordUniversityPress,NY,1991);Gait,editor,Oligonucleotidesynthesis:APracticalApproach(IRLPress,Oxford,1984)
[0025]该发明部分基于DNA或RNA(如mRNA)扩增方法的建立,使用基因组或转录组材料或两者。这种DNA或RNA可能来自于单细胞,或同一种细胞的少数几个细胞。该方法可以用于扩增任何物种或生物体的DNA,可以在一个PCR管里的一个扩增反应。DNA也可以分成若干亚份,用移液枪或其它微量移液设备,使得每一亚份只包含部分原来的DNA,可能代表了亚细胞水平的基因组DNA,即单细胞基因组的DNA的一部分,并得到相应的扩增与分析。该方法可用于并不依赖特定DNA序列的DNA扩增,其DNA可来源于但不限于人,动物,植物,真菌,病毒等真核或原核细胞
[0026]该发明方法可用于扩增几乎整个基因组或转录组的全部基因(分别称为全基因组扩增与全转录组扩增),并不会因为丢失某些特定部位而失去扩增序列的可代表性。‘几乎整个’指包含了全基因组序列的80-99%以上的序列。这种扩增有时会对基因组不同部位的序列造成非等量扩增。
[0027]该发明方法可以在单个反应管或微孔板分两步进行。第一步产生扩增库,所用引物包含一段共同序列,一段可变序列和固定序列,以及至少一个具有链置换活性或核酸核酸外切酶活性的聚合酶。该方法包括一个退火后步骤,即使游离引物与扩增物的末端结合,从而防止扩增物自身或相互结合。这种线性扩增可以明显减少扩增偏向的问题。特定的引物设计与退火后步骤,使得基因组的扩增广度达到了最大化。扩增库的分子在第二步进行标准PCR扩增,用Taq聚合酶以及针对已知序列的引物,从而对全基因组或全转录组进行数千倍的无偏向扩增,其产物可以再进一步扩增至数百万倍以上。
[0028]该发明方法使用至少一个DNA聚合酶进行DNA扩增,引物结合到DNA模板,聚合酶从引物的3’端开始合成互补链。具体步骤可以分为模板DNA的变性,引物与模板DNA的结合,聚合酶在模板上延长引物,合成互补链。
ssDNA,降低温度(退火),引物与ssDNA模板结合,体系中的一个或多个聚合酶在模板上延长引物,合成互补链。DNA聚合酶可能含有5’至3’的核酸核酸外切酶活性或链置换活性。
[0030]第一扩增循环后,新合成的互补链的5’端带有引物的序列。上述变性,退火,延伸步骤再被循环重复。
[0031]每一循环结束后,扩增的DNA分子的一端带有引物的序列,另一端带有引物的互补序列。反应条件适当时,游离引物可以与模板结合,从而防止扩增物自身或相互结合。
[0032]DNA模板可以是基因组DNA,微解剖染色体DNA,YAC,粘粒DNA,噬菌体DNA,PACDNA,BACDNA;可以来自于哺乳动物,植物,真菌,病毒,或原核DNA;可以来自于人,牛,狗,猪,鼠,鸟,鱼,奸,植物,真菌,病毒,或细菌。
[0033]该发明方法所用引物包含一段共同(恒定)序列,一段可变序列与一段固定序列,有时也称为类简并引物。共同序列与可变序列包含基本不与自身或反应中的其它引物互补的序列。共同序列最好是已知的,可以是扩增目标序列。可变序列可以随机选择,也可以根据模板DNA来源与序列特性做相应选择。共同序列是反应中各引物共有的,10-30bp长,不包含C。可变序列3-7bp长,可以包含任何碱基,如果是5个碱基长,则可以有4的5次方个序列组合。固定序列2-4bp长,不含互补序列,如GGG,TTT,GAA,ATG。