在肿瘤免疫中，CD8+T细胞的作用和转化较为成熟。相比较，CD4+T细胞的相关研究较为有限。尽管如此，CD4+T细胞与多种肿瘤的免疫治疗反应、过继T细胞疗法和疫苗的效果紧密相关 （详见BioArt报道：；；；；；） 。一方面，CD4+T细胞的扩增预测临床结局，且CD4+T细胞向Th1和Tfh分化有助于抗肿瘤免疫效果。另一方面，调节性T细胞 （regulatory CD4+T cell，。因此，虽然活化的CD4+T细胞是肿瘤免疫防线的重要组成，但影响CD4+T细胞抗肿瘤效果的机制仍然不清楚。
为了解CD4+T细胞反应的异质性，作者对人肾癌组织分离的PD1+CD45RA-CD4+T细胞行scRNA-seq分析。UMAP分析将PD1+CD45RA-CD4+T细胞分为3群：C1为Treg样，表达FOXP3和L2RA；C2为Th1样，表达TBX21、EOMES和细胞毒分子；C3则为干细胞样，其不表达任何谱系相关转录因子 （lineage-negative，Lin-） ，如BCL6、TBX21、GATA3或RORC，而表达TCF7和干细胞样基因，同时富集干细胞样CD8+T细胞特征基因，表明一种静息状态。流式分析也证实这三种细胞群在肾癌、膀胱癌和前列腺癌存在，表明并不是肾癌独有现象。在肿瘤相关淋巴结中，作者同样发现在PD1+CD45RA-活化CD4+T细胞中，20-60%是TCF1+Lin-的干细胞样细胞群，表明在多种肿瘤组织和淋巴结中TCF1+Lin-是活化CD4+T细胞的主要群体。随后，作者发现TCF1+Lin-CD4+T细胞可以在体外增殖并向Th1、Treg和Tfh亚群分化。另外scRNA-seq和scTCR-seq分析表明肾癌组织内TCF1+Lin-CD4+T细胞和其他Treg等亚群的TCR有重叠，表明这些细胞存在谱系关系。这些结果说明TCF1+Lin-CD4+T细胞具有干细胞样特征并作为前体细胞进一步分化为效应细胞亚群。
紧接着，作者使用表达LCMV糖蛋白 （glycoprotein，GP） 的TRAMPC1细胞接种小鼠以在体内监测抗原特异性TCF1+Lin-CD4+T细胞的功能和分化动力学。在第星空体育 星空体育平台一周，GP66+CD4+T细胞在淋巴结迅速扩增并持续存在，且已经出现TCF1+Lin-CD4+T细胞群。5周后，淋巴结内GP66+CD4+T细胞存在TCF1+Lin-、Foxp3+和Bcl6+群，以及小部分Tbet+和RORγt+细胞群。在肿瘤内，大部分GP66+CD4+T细胞为Treg样，小部分为TCF1+Lin-。之后，作者将从SMARTA小鼠 （表达LCMV GP特异性TCR） 分离的初始CD4+T细胞过继入TRAMPC1细胞接种的小鼠，同样发现类似的分化轨迹。与此同时，分离TRAMPC1细胞接种小鼠淋巴结的TCF1+Lin-CD4+T细胞并过继入正常小鼠后给予LCMV感染，发现大部分过继细胞分化为Th1和Tfh细胞，小部分为Treg，表明TCF1+Lin-CD4+T细胞的分化亚群方向取决于所处环境。总之，这些结果进一步说明TCF1+Lin-是一种干细胞样CD4+T细胞。
前述结果表明肿瘤及其淋巴结Treg占PD1+CD4+T细胞主要群体，作者猜想Treg是否抑制TCF1+Lin-CD4+T细胞向其他效应亚群分化。Foxp3-DTR小鼠结合TRAMPC1细胞接种实验证实Treg缺陷后GP66+CD4+T细胞显著扩增且向Th1分化，且非抗原特异性CD4+T细胞也向Th1分化。scRNA-seq表明Treg缺失时，TCF1+Lin-CD4+T细胞在保留干细胞基因同时上调Th1相关基因表达。TCR-seq进一步证实Treg缺失促进的Th1细胞与TCF1+Lin-CD4+T细胞的TCR存在90%重叠，表明TCF1+Lin-CD4+T是Th1细胞的前体细胞。随后，作者分选TRAMPC1细胞接种小鼠的SMARTA干细胞样细胞或Treg细胞后过继入WT或Foxp-DTR小鼠，2天后白喉毒素处理。5天后分析发现，WT小鼠内过继的干细胞样细胞在淋巴结存在，小部分向Treg和Tfh分化；而Treg缺失时，过继的干细胞样细胞大量分化为Th1细胞。过继的SMARTA Treg则无论Treg是否敲除均保留Foxp3表达。这些结果说明TCF1+Lin-细胞在肿瘤中可以向Th1分化，但能被Treg抑制。
那么这种TCF1+Lin-CD4+T细胞来源的Th1细胞分化对抗肿瘤免疫是否有用？作者在TRAMPC1-GP 和B16F10-GP两种肿瘤模型中发现，CD4+T细胞删除削弱抗肿瘤免疫，且CD4+T细胞的作用依赖于CD8+T细胞。CD4+T细胞删除引起淋巴结干细胞样CD8+T细胞扩增但效应分化显著降低，而Treg删除则可以促进CD8+T细胞效应分化和扩增，提示干细胞样CD4+T细胞或Th1细胞诱导淋巴结CD8+T细胞的效应功能。为了厘清哪种细胞起作用，作者在SMARTA T细胞中构建四环素诱导的TBET过表达荷瘤小鼠内。相比于对照组，四环素诱导联合PDL1抑制剂有效促进CD4+T细胞的Th1分化以及CD8+T细胞的扩增和效应分化，并展现良好的肿瘤控制，表明Th1亚群促进CD8+T细胞的效应分化。相反，当作者在四环素TBET过表达的 SMARTA T细胞中敲除IFNγ时，上述TBET过表达介导的CD4+/CD8+T细胞效应分化和抗肿瘤效应消失。同样，缺失Ifngr1的CD8+T细胞不再对CD4+T细胞反应。最后，作者在人肾癌组织中发现Th1细胞频率与效应CD8+T细胞浸润以及肿瘤免疫抑制剂治疗效果正相关。
这些结果均表明Th1细胞分泌的IFNγ在诱导CD8+T细胞抗肿瘤中的重要作用。
综上所述，这项研究揭示肿瘤特异性TCF1+Lin-干细胞样CD4+T细胞具有增殖和分化能力，其分化亚群方向对CD8+T细胞的抗肿瘤免疫起到重要作用，为靶向CD4+T细胞的肿瘤免疫疗法提供理解和应用思路。
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