在1950s，thomas等发现骨髓来源的造血干细胞(hematopoieticstemcell,hsc)可重建造血系统，从而治愈包括白血病、多发性骨髓瘤(mds)等多种恶性血液疾病，随后在世界范围内hsc的临床治疗广泛开展，随着医学的发展，细胞生物学、分子生物学领域的研究不断深入，hsc的临床适应症不断被发现，hsc的医学价值愈加彰显。
由于bm-hsc和pb-hsc的采集都需要从人体中直接抽取，抽取前需要对供者先进行复杂的预处理和动员过程，因此对供者，无论是异体和自体都有直接的伤害，尤其对处于治疗阶段的自体供者。而脐带血造血干细胞(ucb-hsc)的采集过程完全不会对供者造成任何伤害，步骤简单且迅速，具有bm-hsc和pb-hsc无可比拟的优点，这也是ucb-hsc在世界范围内广泛用于临床治疗的重要原因之一。
目前ucb-hsc的临床适应症已超过40种，包括：白血病、再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤、地中海贫血等血液疾病，以及was综合征等遗传性代谢疾病和某些实体瘤，具有极其重要的医学价值。由于脐带血是在婴儿成功分娩结扎脐带后，从脐静脉中抽取的，相对于骨髓来源的造血干细胞，脐带血可抽取的体积确实相对较少，于是普遍被误会，认为脐带血来源的造血干细胞只能用于体重小的患者(主要是儿童)，这种误会制约着ucb-hsc的临床应用发展。其实对于造血干细胞的移植和输注治疗，最重要的参数是总有核细胞数(totalnuclearcells,tnc)以及cd34+细胞比例，二者的乘积为cd34+细胞总数，也就是hsc的总数，只要hsc总数满足临床要求，ucb-hsc同样可以用于成人患者。
由于采集方便安全以及对供者不会造成任何伤害，ucb-hsc有着其他来源hsc无可比拟的优点，所以如果能在体外扩增hsc从而提高hsc的总数，将会极大消除一直以来对ucb-hsc的误会，使ucb-hsc具有广泛的认知，从而救助更多患者，并相对减少bm-hsc和pb-hsc供者，从而减少社会的医疗负担。
hsc扩增方面的研究，目前常用的扩增方法是通过细胞因子的组合实现的，如：il-3、il-6、flt-3、tpo等。单纯的细胞因子组合的扩增体系已被世界上许多实验室采用多年，尽管不同的实验室会采用不同的组合方式，而对于扩增的结果，有的提高了hsc细胞数量，有的则提高了cd34+细胞比例，均没有突破性成果。因此，单纯的细胞因子组合的扩增体系，无论在hsc最终生成数量还是cfu-gm集落形成能力上均已遇到瓶颈，这对于未来ucb-hsc的更广泛使用，并没有突破性的支持。因此，探索新的更高效的扩增方法对于将来ucb-hsc更广泛的运用具有实质性的意义。
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明提供了一种脐带血造血干细胞的扩增方法；本发明提供了qs11的一种用途；本发明提供了一种细胞扩增培养基。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述qs11在细胞扩增培养基中的浓度为0.25～4μmol/l；优选地，qs11在细胞扩增培养基中的浓度为1μmol/l。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述细胞扩增培养基中还含有细胞因子，所述细胞因子为il-6、il-3、tpo、scf、flt-3中的至少一种。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述细胞扩增培养基为含有qs11和il-6、il-3、tpo、scf和flt-3的stemspan培养基。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述il-6在细胞扩增培养基中的浓度为20ng/ml、所述il-3在细胞扩增培养基中的浓度为20ng/ml、所述tpo在细胞扩增培养基中的浓度为50ng/ml、所述scf在细胞扩增培养基中的浓度为50ng/ml、所述flt-3在细胞扩增培养基中的浓度为20ng/ml。
一种脐带血造血干细胞的扩增方法，所述方法以脐带血造血干细胞为标本细胞，使用上述所述的细胞扩增培养基进行扩增培养，得到造血干细胞。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述的脐带血造血干细胞的扩增方法，具体包括如下具体步骤：
(2)将步骤(1)得到的qs11储存溶液添加到基本培养基中，得到细胞扩增培养基；
(3)将脐带血造血干细胞接种至步骤(2)得到的细胞扩增培养基中进行扩增培养，得到更大量的造血干细胞。
作为对上述技术方案的进一步改进，步骤(1)中所述的qs11的纯度≥99％，gc；所述的qs11储存溶液浓度为10mmol/l，该浓度为储存浓度，扩增时直接使用储存浓度并根据样本体积进行浓度调配，储存溶液须放置于4℃遮光保存；所述的细胞保护剂优选为甲基亚砜(dmso)。
作为对上述技术方案的进一步改进，步骤(2)中所述的细胞扩增培养基中qs11的浓度为0.25～4μmol/l；优选为1μmol/l；所述的基本培养基中还含有细胞因子，所述的细胞因子为il-6、il-3、tpo、scf或flt-3中的至少一种。所述的细胞因子il-6在细胞扩增培养基中的浓度优选为20ng/ml、所述il-3在细胞扩增培养基中的浓度优选为20ng/ml、所述tpo在细胞扩增培养基中的浓度优选为50ng/ml、所述scf在细胞扩增培养基中的浓度优选为50ng/ml、所述flt-3在细胞扩增培养基中的浓度优选为20ng/ml。
作为对上述技术方案的进一步改进，步骤(3)中所述的细胞保护剂为二甲基亚砜(dmso)；步骤(3)中所述的扩增培养的培养条件为：在37℃，co2浓度为5％的条件下培养；步骤(3)中所述的定向分化培养的时间为1～7天。
①采集的新鲜脐带血，通过ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，经过离心后，收集白膜层，加生理盐水重悬再离心，然后加入细胞保护剂后程控降温，得到脐带血造血干细胞，随后将脐带血造血干细胞储存于液氮中；
②诱导分化前，先将脐带血造血干细胞解冻，加生理盐水重悬洗涤再离心，收集得到脐带血造血干细胞。
(1)本发明通过添加微量的qs11显著提高了造血干细胞的扩增效果，有效提高了脐带血造血干细胞扩增所获得的细胞总数量，进而为更广泛的临床试验提供前期技术基础，且本发明的操作简便。
(2)本发明扩增后的造血干细胞具有更优异的cfu集落形成能力，表明这些造血干细胞具有更强的构建血液系统的分化潜力，意味着使用相同数量的造血干细胞最终能产生更大量的各种成体血细胞，可以更有效地支持临床治疗需要。
(3)本发明提供了一种含有qs11的扩增培养基，使得造血干细胞定向分化操作更简便安全和高效。
图1是各浓度qs11培养基作用下，脐带血造血干细胞各样本在第1、4、7天的细胞总数量变化的结果图。
图2是各浓度qs11培养基作用下，脐带血造血干细胞各样本在第4、7天相对于第1天的细胞总数量的扩增倍数分析图。
图3是各浓度qs11培养基作用下，脐带血造血干细胞各样本在第1、4、7天的cd34+表面抗原表达情况分析图。
图4是各浓度qs11培养基作用下，脐带血造血干细胞各样本在第1、4、7天的cd34+细胞总数量分析图。
图5是各浓度qs11培养基作用下，脐带血造血干细胞各样本在第4、7天相对于第1天的cd34+细胞总数量的扩增倍数分析图。
下述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
stemspan培养基购自stemcell公司；细胞保护剂为纯的dmso溶液；脐带血采自健康产妇孕婴，经检测乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋病、巨细星空体育 星空体育平台胞病毒、torch检测、支原体、衣原体、g-6pd和地贫均为阴性。标本自采集到运回广东省脐带血库的运输条件保持在4～8℃。按以下方法进行造血干细胞扩增操作：
qs11(≥99％，gc)，溶解于细胞保护剂中，配制成浓度为10mmol/lqs11储存溶液；
细胞扩增培养基：stemspan培养基中添加细胞因子组合：il-6(在细胞扩增培养基中的浓度为20ng/ml)、il-3(在细胞扩增培养基中的浓度为20ng/ml)、tpo(在细胞扩增培养基中的浓度为50ng/ml)、scf(在细胞扩增培养基中的浓度为50ng/ml)和flt-3(在细胞扩增培养基中的浓度为20ng/ml)；
含有qs11的细胞扩增培养基：将上述配制的qs11储存溶液添加到细胞扩增培养基中，得到含有qs11的扩增培养基；其中，qs11在细胞扩增培养基中的浓度为0.25μmol/l。
从采集运输到库在4小时内的新鲜健康人脐带血中获取富含cd34+造血干细胞的单个核细胞层，程控降温，冷冻于液氮中保存；扩增前解冻复苏，然后接种于6孔板中，加入含有qs11的扩增培养基。具体过程如下：
(1)采集新鲜的脐带血，4小时内运回广东省脐带血库，通过ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，经过离心后，收集白膜层(白膜层在血浆层和分离液层中间)，加生理盐水重悬洗涤，加入细胞保护剂后，经程控降温仪降温并冷冻保存于液氮中；
(2)将步骤(1)制得的脐带血造血干细胞解冻复苏，转移至离心管，总体积约10ml，加入30ml生理盐水(3倍体积)，洗涤1次，离心力200g，离心8分钟，收集细胞沉淀，即得脐带血造血干细胞。
把脐带血造血干细胞接种在6孔培养板上，加入含有qs11的扩增培养基，使得各个样本对应相应的qs11浓度；
(1)造血干细胞的形态学分析及细胞计数：将培养的细胞在倒置显微镜观察细胞状态并拍照。取微量细胞悬液，计算细胞数量。
(2)流式细胞仪的表型测定：分别取培养后第1天，第4天，第7天的细胞，进行cd34+表面抗原检测。
(3)造血干细胞的cfu集落形成能力测定：分别取培养后第4天，第7天细胞接种于6孔板半固体培养基methoculttmh4434classic中，接种细胞浓度为5×103/ml，于温度37℃、5％co2的培养箱中进行周期为14天的cfu集落培养。实施例2
实施例2的具体实验细节同上述实施例1，不同点在于含有qs11的细胞扩增培养基中，qs11在细胞扩增培养基中的浓度为0.5μmol/l。
实施例3的具体实验细节同上述实施例1，不同点在于含有qs11的细胞扩增培养基中，qs11在细胞扩增培养基中的浓度为1μmol/l。
实施例4的具体实验细节同上述实施例1，不同点在于含有qs11的细胞扩增培养基中，qs11在细胞扩增培养基中的浓度为2μmol/l。
实施例5的具体实验细节同上述实施例1，不同点在于含有qs11的细胞扩增培养基中，qs11在细胞扩增培养基中的浓度为4μmol/l。
实施例6为空白对照组(control)，具体实验细节同上述实施例1，不同点在于含有qs11的细胞扩增培养基中，qs11在细胞扩增培养基中的浓度为0μmol/l。
(1)倒置显微镜下观察接种后第1天的脐带血造血干细胞，细胞数量充星空体育 星空体育平台足，形态较为单一，呈分散状态，细胞饱圆，胞体透亮。
(2)倒置显微镜下观察接种后第4天的脐带血造血干细胞扩增状况，与第1天相比，细胞总数量略有增加，形态没有出现分化迹象，呈较分布状排列。
对比于第1天，细胞数量比值分别为：135％、119％、105％、93％、88％和55％；如图2所示。
(3)倒置显微镜下观察接种后第7天的脐带血造血干细胞的扩增状况，与第4天相比，细胞数量大幅增加，形态没有分化，细胞饱圆，胞体透亮。
在流式结果方面，cd34+细胞的比例，除了4μmol/l样本明显低于control，其他样本均高于control。
总概而言，含有1μmol/lqs11的扩增培养基显著提高了造血干细胞的扩增总数量，同时提高了cfu的集落生成能力；在培养过程的各个阶段均对造血干细胞的产生数量有提升作用，尤其第4～7天阶段，细胞总数和cd34+细胞总数比其他所有样本有更明显的增长；流式结果同样优于其他浓度的qs11样本从而全面提高了造血干细胞的扩增效果，且操作过程简单、安全。故优选含有1μmol/lqs11的扩增培养基。
cfu集落数目方面，不同浓度的qs11结果分别为：105个、107个、99个、140个、116个、117个。
总概而言，含有1μmol/lqs11的扩增培养基，细胞增殖比例明显高于control，流式结果方面虽然略低于control，但在cd34+细胞增殖比例依然高于control，同时cfu的集落生成能力也显著高于control；各项结果综合而言也优于其他浓度的qs11样本，结论与实施例1相同，故优选含有1μmol/lqs11的扩增培养基。
cfu集落数目方面，不同浓度的qs11结果分别为：105个、101个、113个、108个、127个、122个。
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