本发明提供了一种单抗或重组蛋白大规模生产中细胞扩增的方法。具体而言，本发明提供了一种细胞扩增的方法，其包括：将细胞依次进行复苏、CO2摇床批式培养，之后在20L‑100L生物反应器中先进行批式培养再进行灌注培养。本发明的细胞扩增方法结合了细胞批式培养(batchculture)和灌注培养(perfusionculture)技术，只需一个较小体积的生物反应器扩增，即可满足最终大规模细胞培养的种子细胞量，大大缩短扩增时间，节约成本，减少设备占用空间，维持或者提高所产生重组蛋白或单抗的质量。
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 112680396 A (43)申请公布日 2021.04.20 (21)申请号 5.9 (22)申请日 2019.10.18 (71)申请人 东曜药业有限公司 地址 215024 江苏省苏州市苏州工业园区 长阳街120号 (72)发明人 刘冬连牛赛超王雨滨吴郡一 (74)专利代理机构 北京三友知识产权代理有限 公司 11127 代理人 韩蕾周达 (51)Int.Cl. C12N 5/00(2006.01) 权利要求书1页 说明书4页 附图4页 (54)发明名称 单抗或重组蛋白大规模生产中细胞扩增的 方法 (57)摘要 本发明提供了一种单抗或重组蛋白大规模 生产中细胞扩增的方法。具体而言，本发明提供 了一种细胞扩增的方法，其包括：将细胞依次进 行复苏、CO 摇床批式培养，之后在20L-100L生物 2 反应器中先进行批式培养再进行灌注培养。本发 明的细胞扩增方法结合了细胞批式培养(batch culture)和灌注培养(perfusion culture)技 术，只需一个较小体积的生物反应器扩增，即可 满足最终大规模细胞培养的种子细胞量，大大缩 短扩增时间，节约成本，减少设备占用空间，维持 或者提高所产生重组蛋白或单抗的质量。 A 6 9 3 0 8 6 2 1 1 N C CN 112680396 A 权利要求书 1/1页 1.一种细胞扩增的方法，其包括： 将细胞依次进行复苏、CO 摇床批式培养，之后在20L-100L生物反应器中先进行批式培 2 养再进行灌注培养。 2.根据权利要求1所述的方法，其中CO 摇床批式培养10-12天后接种20L-100L生物反应 2 器。 9 3.根据权利要求1或2所述的方法，其中CO 摇床批式培养至细胞密度达到4×10-10× 2 9 10cells/mL后进行20L-100L生物反应器批式培养。 4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中生物反应器中先进行批式培养至细胞密 6 6 度达到5×10-10×10cells/mL后进行灌注培养。 6 6 5.根据权利要求1所述的方法，其中灌注培养使细胞密度达到20×10-100×10cells/ mL后，接种到最终规模的生产反应器中进行大规模培养。 6.根据权利要求1所述的方法，其中，用于灌注培养的生物反应器为带细胞截留系统的 生物反应器。 7.根据权利要求6所述的方法，其中，生物反应器为带细胞截留装置的一次性的WAVE反 应器； 或者，生物反应器为一次性或不锈钢搅拌式生物反应器，所述生物反应器配置细胞截 留系统Biosep或ATF系统或其他细胞截留装置。 8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其中，生产反应器为1000L、2000L、4000L、 5000L、6000L、8000L、10000L生物反应器中的一个或多个的组合。 9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞包括但不限于CHO、骨髓瘤细胞(如NSO、 SP2/0细胞)、杂交瘤细胞、PerC.6或HEK293细胞。 10.权利要求1-9任一项所述的方法在生产抗体或重组蛋白中的应用。 2 2 CN 112680396 A 说明书 1/4页 单抗或重组蛋白大规模生产中细胞扩增的方法 技术领域 [0001] 本发明是关于一种细胞扩增的方法，具体地说，是关于一种应用于单抗或重组蛋 白大规模生产中的细胞扩增的方法。 背景技术 [0002] 从应用哺乳动物细胞表达重组蛋白(如细胞因子和单克隆抗体)的技术诞生以来， 细胞培养技术、无血清培养基以及用于细胞培养的生物反应器技术在不断地发展，并获得 了长足的进步。治疗性单抗的临床剂量大(10mg-1000mg/瓶)，需大体积的生物反应器来培 养细胞，以满足市场的需求。 [0003] 目前商业化生产单克隆抗体的规模达到200-20000L。用于末端大规模生产抗体的 细胞培养方式主要有两种：流加式培养(Fed-batch culture)和灌注培养(Perfusion culture)。流加式培养的过程是：先以基础培养基进行细胞培养，当细胞达到一定数量后 7 (如1×10cells/mL)定期(如隔天)在培养系统中补加一定比例的新鲜补料培养基(高浓度 培养基)，以满足高密度细胞对营养的需求；此方法的优点是操作简单，产品质量均一性好， 单位体积的表达量高，成本低；但是，该方法需要大体积的生物反应器，培养周期较短，大量 累计的细胞代谢废物(如NH4+，高渗透压等)对细胞的生长和维持不利，生产周期一般在12- 16天之间。灌注培养的优点是：细胞密度高，细胞培养生长和维持的时间长(30-60天)，收获 的培养上清体积大，可用小体积的生物反应器来生产即可满足市场的需求；但是，单位体积 的表达量低，成本高。 [0004] 5 不管上述何种培养方式，细胞种子的密度均需要达到一定的数量(如3×10-10× 5 10cells/mL)细胞方能正常生长。至目前为止，位于生产上游的细胞扩增均是采用批式培 养(Batch culture)的方式。细胞种子批式扩增的方法是：细胞复苏→CO 摇床批式培养 2 (10-12天)→10L生物反应器批式培养(5-6天)→50L生物反应器批式培养(5-6天)→200L生 物反应器批式培养(5-6天)→1000L生物反应器批式培养(5-6天)，获得足够的细胞种子后 将细胞接种到最终生产的反应器中培养(2000-20000L)。该细胞扩增方式的缺点是：设备占 地空间大，设备投资巨大，培养周期长，表达产物(细胞扩增期间表达的抗体或目的蛋白)在 较高温度下(一般培养温度为37℃)维持的时间长，对产品的质量均一性有明显的影响。 发明内容 [0005] 本发明的目的是提供一种改进的细胞扩增方法，应用于单抗或重组蛋白等蛋白的 大规模生产。 [0006] 为实现上述目的，本发明提供了一种新的细胞扩增方法，其结合了细胞批式培养 (batch culture)和灌注培养(perfusion culture)技术。本发明中称该方法为PB hybrid 细胞扩增技术(PB hybrid cell amplification technology)，简称PB hybrid技术，P代表 perfusion，B代表batch。 [0007] 根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法，其包括： 3 3 CN 112680396 A 说明书 2/4页 [0008] 将细胞依次进行复苏、CO 摇床批式培养，之后在20L-100L生物反应器中先进行批 2 式培养再进行灌注培养。 [0009] 根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，CO 摇床批式培养10- 2 12天后接种20L-100L生物反应器。 [0010] 根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，CO 摇床批式培养至细 2 9 9 胞密度达到4×10-10×10cells/mL后进行20L-100L生物反应器批式培养。 [0011] 根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，生物反应器中先进行 6 6 批式培养至细胞密度达到5×10-10×10cells/mL后进行灌注培养。 [0012] 根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，灌注培养使细胞密度 6 6 达到20×10-100×10cells/mL后，接种到最终规模的生物反应器中进行大规模培养。 [0013] 根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，用于灌注培养的生物 反应器可以是一次性的WAVE生物反应器(自带细胞截留装置)，也可以是一次性或不锈钢搅 拌式生物反应器(细胞截留装置可选择Applikon公司的Biosep，或美国Repligen公司的ATF 系统，或其他公司的任何一款细胞截留系统)。 [0014] 根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，生产反应器为1000L、 2000L、4000L、5000L、6000L、8000L、10000L生物反应器中的一个或多个的组合。 [0015] 根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，所述细胞包括但不限 于CHO、骨髓瘤细胞(如NSO、SP2/0细胞)、杂交瘤细胞、PerC.6或HEK293细胞。 [0016] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，20L-100L生物反 应器批式培养1-3天后，可根据需要补充培养基，再进行批式培养至所需细胞密度。 [0017] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，20L-100L生物反 应器批式过程中，设置培养条件：pH6.8-7.3，优选为7.0-7.2，最佳为7.1-7.15；温度35-38 ℃，优选为36-37℃，最佳为36.5-37℃。反应器摇摆角度3-8°，优选位4-6°，最佳为4-5°，摇 摆振幅10-15rpm，优选为12-14rpm。 [0018] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，20L-100L生物反 应器灌注培养过程中，设置培养条件：pH7.0-7.2，温度36-37℃，摇摆角度8-10°，摇摆振幅 15-20rpm，起始灌注的体积为0.2-0.5CV(培养体积)，随着细胞密度增加，可每天增加灌注 的体积，如1CV,1.2CV，1.5CV，1.8CV，2CV，3CV等，直到细胞达到所需密度。 [0019] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，20L-100L生物反 应器培养过程中，反应器摇摆角度和摇摆振幅对调节pH和控制溶氧非常关键，角度和振幅 过小，不能维持高密度细胞对溶氧的需求，不能有效排除CO2,维持培养液pH；反之，角度和 振幅过大，会产生大量泡沫，对细胞造成损伤。 [0020] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，20L-100L生物反 应器批式培养过程中，设置培养条件：pH6.8-7.3，优选为7.0-7.2，最佳为7.1-7.15，温度 35-38℃，优选为36-37℃，最佳为36.5-37℃，转速50-60rpm，溶氧30-80％。 [0021] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法星空体育 星空体育平台中，20L-100L生物反 应器灌注培养过程中，设置培养条件：pH7.0-7.2，温度36-37℃，转速60-80rpm，溶氧30- 80％。 [0022] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，20L-100L生物反 4 4 CN 112680396 A 说明书 3/4页 应器灌注培养过程中，起始灌注的体积为0.2-1CV(培养体积)，随着细胞密度增加，每天增 加灌注的体积，如1.2CV，1.5CV，1.8CV，2CV，3CV等。 [0023] 本发明的细胞扩增的方法，可应用于生产抗体或重组蛋白，例如治疗性单抗(如贝 伐株单抗等)或其它重组蛋白(如红细胞生成素(EPO)等)。从而，本发明还提供了所述的细 胞扩增方法在生产抗体或重组蛋白中的应用。 [0024] 本发明的有益技术效果： [0025] 本发明的细胞扩增方法，只需一个较小体积的生物反应器扩增，即可满足最终大 规模细胞培养的种子细胞量，大大缩短扩增时间，同时，在灌注培养的过程中，表达的目的 蛋白不断被排出，当细胞种子接种到最后的反应器中时，从种子中带来的目的蛋白非常少， 可延长后期细胞培养的周期而不影响产品的质量，该细胞扩增方法的优点是：节省大量设 备投资，占地面积小，可节省20％以上的批生产成本。 附图说明 [0026] 图1A显示本发明实施例1的PB hybrid细胞扩增方式的细胞生长曲线B显示传统细胞扩增方式的细胞生长曲线A显示传统细胞扩增方式与本发明实施例1的PB hybrid细胞扩增方式中NH4+含 量变化曲线B显示传统细胞扩增方式与本发明实施例1的PB hybrid细胞扩增方式中乳酸 代谢曲线显示传统细胞扩增方式与本发明实施例1的PB hybrid细胞扩增方式获得的种 子细胞在2000L反应器中的生长曲线显示传统细胞扩增方式与本发明实施例1的PB hybrid细胞扩增方式获得的种 子细胞在2000L反应器中的抗体表达量。 [0032] 图5显示传统细胞扩增方式与本发明实施例1的PB hybrid细胞扩增方式获得的种 子细胞在2000L反应器中生产的抗体电荷异质性比较。 具体实施方式 [0033] 以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅 读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。实施例中，未注明 具体条件的实验方法按照所属领域熟知的常规方法和常规条件进行，或按照仪器说明书建 议的操作条件进行。 [0034] 实施例1 [0035] 9 9 以CHO细胞，细胞复苏后在摇瓶中扩增到4×10-10×10cells，接种25LWave反应 6 6 器(含10L培养基)，批式培养1-2天，细胞密度达到1×10-2×10cells/mL,补充培养基至 25L，批式培养3-4天，在批式培养过程中，设置培养条件：pH6.8-7.3，优选为7.0-7.2，最佳 为7.1-7.15温度35-38℃，优选为36-37℃，最佳为36.5-37℃。反应器摇摆角度3-8°，优选位 6 4-6°，最佳为4-5°，摇摆振幅10-15rpm，优选为12-14rpm,。当细胞密度达到6×10-10× 6 10 cells/mL时开始灌注培养，设置培养条件：pH6.8-7.3，优选为7.0-7.2，最佳为7.1- 7.15，温度35-38℃，优选为36-37℃，最佳为36.5-37℃，摇摆角度8-10，优选为5-9，更佳为 5 5 CN 112680396 A 说明书 4/4页 6-7°，摇摆振幅15-20rpm，起始灌注的体积为0.2-0.5CV(培养体积)，随着细胞密度增加，每 6 天增加灌注的体积，如1CV,1.2CV，1.5CV，1.8CV，2CV，3CV等，直到细胞达到50×10-80× 6 10cells/mL，获得足够的种子细胞后接种2000L反应器。 [0036] 最终培养体积为2000L，生物反应器为一次性生物反应器。 [0037] 图1A显示了本实施例的PB hybrid细胞扩增方式的细胞生长曲线B显示了传 统细胞扩增方式的细胞生长曲线A显示了传统细胞扩增方式与本实施例的PB hybrid + 细胞扩增方式中NH 含量变化曲线B显示了传统细胞扩增方式与本实施例的PB hybrid 4 细胞扩增方式中乳酸代谢曲线。注：Batch培养中中国仓鼠卵巢细胞(CHO)在细胞生长平台 期(Day5后)自己消耗乳酸，使乳酸含量降低；在PB hybrid扩增中，因细胞一直快速生长，仍 然在产生乳酸，但由于灌注培养，乳酸浓度随着培养基的排除而降低，因此，两者乳酸下降 的机理完全不同。图3显示了传统细胞扩增方式与本实施例的PB hybrid细胞扩增方式获得 的种子细胞在2000L反应器中的生长曲线显示了传统细胞扩增方式与本实施例的PB hybrid细胞扩增方式获得的种子细胞在2000L反应器中的抗体表达量。 [0038] 可以看出，本实施例，与传统传统细胞扩增方式相比，所产生重组蛋白或单抗的质 量和表达量有显著提高。 [0039] 实施例2 [0040] 9 9 以NSO细胞为例，细胞复苏在摇瓶中扩增到4×10-10×10cells，接种50L不锈钢 6 6 反应器(首先含10L培养基)，批式培养2-3天，细胞密度达到2×10-3×10cells/mL,补充培 养基至40-50L，培养3-4天，培养条件为：pH6.8-7.3，优选为7.0-7.2，最佳为7.1-7.15，温度 35-38℃，优选为36-37℃，最佳为36.5-37℃，转速50-60rpm，溶氧30-80％。当细胞密度达到 6 6 6×10-10×10 cells/mL时开始灌注培养，细胞截留装置为Biosep，培养条件为：pH6.8- 7.3，优选为7.0-7.2，最佳为7.1-7.15，温度35-38℃，优选为36-37℃，最佳为36.5-37℃，转 速60-80rpm，溶氧30-80％。起始灌注的体积为0.2-0.5CV(培养体积)，随着细胞密度增加， 6 每天增加灌注的体积，如1.0CV，1.2CV，1.5CV，1.8CV，2CV，3CV等，当细胞种子达到50×10- 6 100×10cells/mL，接种5000L生物反应器。在灌注培养过程中，需要对Biosep的功率随着 灌注速度进行调整，并逐步增加，提高细胞截留的效率，减少细胞流失。 [0041] 最终培养体积为5000L，反应器为不锈钢生物反应器。 [0042] 本实施例，与传统传统细胞扩增方式相比，所产生重组蛋白或单抗的质量和表达 量有显著提高。 [0043] 在上述实例实施过程中，实施例1节省细胞扩增时间9-10天；在实施例2实施过程 中，细胞扩增时间缩短12-15天。因此，本发明的技术，大大缩短了细胞培养的周期，节省生 产周期，提高了设备的利用率。 [0044] 特别地，该技术对温度敏感的抗体的质量有显著的提高，如降低了抗体的酸峰含 量，提高抗体电荷均一性(提高主峰含量)，从而提高抗体的生物学活性(图5)。 6 6 CN 112680396 A 说明书附图 1/4页 图1A 图1B 7 7 CN 112680396 A 说明书附图 2/4页 图2A 图2B 8 8 CN 112680396 A 说明书附图 3/4页 图3 图4 9 9 CN 112680396 A 说明书附图 4/4页 图5 10 10
2、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问加。
3、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
4、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
内饰颜色选项高级附加功能the haigbrochure宣传册.pdf
为了后续能方便生产及追查校准否出问题针对项目作业指导working guide.pdf
苏教版四年级上册数学第四单元《简单的统计表和条形统计图》教学课件.pptx
原创力文档创建于2008年，本站为文档C2C交易模式，即用户上传的文档直接分享给其他用户（可下载、阅读），本站只是中间服务平台，本站所有文档下载所得的收益归上传人所有。原创力文档是网络服务平台方，若您的权利被侵害，请发链接和相关诉求至 电线) ，上传者