原代培养期:从体内取出组织接种培养到第 一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。 这个阶段细胞比较活跃，有细胞分裂，但 不旺盛。 传代期：从原代培养的细胞的一经传代后 便称细胞系。细胞增殖旺盛，当传代10-50 次后，细胞增殖缓慢，以致完全停止。 衰退期：细胞增殖缓慢或不增殖。细胞轮 廓增强，最后衰退凋亡。
但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞 从瓶壁脱落下来，进行传代。采用酶 消化法传代。常用的消化液有0.25％ 的胰蛋白酶液。
贴壁细胞细胞在培养瓶长成致密单层后， 继续生长的空间不足，培养基中的营养 成份也消耗较多，同时代谢废物也有较 多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传 代扩增。
(3)繁殖期： 圆形悬浮细胞贴壁后延展成极性细胞， 此时虽有细胞运动，却无细胞分裂。经 过一段停滞，开始分裂。随着细胞数量 的增多，细胞间开始接触并连接成片， 这时细胞的运动及分裂都会停止。这种 由于细胞间的接触而发生抑制的现象称 之为接触性抑制。
细胞长满培养瓶壁达到一定密度后，随 着营养物的消耗和代谢物的积累，细胞 开始退化。细胞轮廓变强，细胞内有膨 胀的线粒体颗粒堆积。如不及时传代， 细胞会从瓶壁上脱下来。
和计数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左 侧和上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单 个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制
1．悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清， 沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将 上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直 接吹打形成细胞悬液再传代。
如消化过头，会见到许多细胞脱落随弃 去的胰酶溶液流失。也可以在倒数第二、 三步时弃去胰酶，用瓶中残留的胰酶继 续作用至最后一步的消化程度，这样略 有点过也影响不大。
检查细胞形态及活力：状态良好的细胞 应是轮廓不十分清晰，而生长不良的细 胞轮廓反而清晰，细胞间隙增大，有空 泡、脂滴、颗粒出现，细胞形态不规则。
新鲜的呈桃红色，PH在7.2-7.4之间。 培养一段时间后，PH下降，培养液变黄。 ＣＯ２培养箱可自动控制5%ＣＯ２ 的含 量。
贴壁培养的系统主要有转瓶、中空纤维、 玻璃珠、微载体系统等。转瓶培养系统 的核心是采用可以摇动或转动的圆筒培 养容器，能使细胞交替接触培养液和空 气。但是，该系统具有表面积有限、培 养条件检测受到限制、劳动强度大、占 用空间大等不足。
凡· 维茨尔开发的微载体培养系统一定程 度上克服了这些缺陷。 微载体培养动物细胞是一种适合大规 模生产动物细胞生物制品的一种非常有 价值的培养技术
注意： 镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如 细胞团占10%以上,说明消化不充分；细胞数少于200个/10平方毫米或多 于500个/10平方毫米 时，均说明稀释不当，需重新置备细胞悬液,再计算。
细胞悬液制备后，要计算所含的细胞数 量。一般以细胞数/毫升表示。 用品：细胞 悬液,培养液,计数板。
倍体细胞系（Diploid Cell Line）。为保持二倍体细胞性质，细
胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均 在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适 宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性 质或发生转化。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐
贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表 面进行的培养。大多数动物细胞在离体 培养条件下都需要附着在带有适量正电 荷的固体或半固体表面才能正常生长， 最终在附着表面扩展成单层。
贴壁培养的表面要求具有净阳电荷和 高度的表面活性。如果是有机物表面， 必须具有亲水性，并带阳电荷。主要 材料有： 玻璃 、塑料、 金属、微载体。
细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞 从细胞瓶壁上洗下，将细胞悬液用吸管吹散后传代： 有经验后，可肉眼对光观察帖壁半透明的细胞层，判断消化程度。
也称初代培养，即从体内星空体育官方入口 星空体育官网取出组织接种培养到第一次传代阶段，一 般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初
异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互 依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行
培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存
性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细 胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培
初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。在 全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细 胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二
在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成 异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后 的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。
所谓培养瓶培养法，就是将培养对象直接接 种于培养瓶内，再放人培养箱进行培养。 早期的培养瓶是玻璃培养瓶，目前主要用 一次性的塑料培养瓶。与一般瓶子不同，采用 的材料都是透明、对生物细胞无毒的材料。采 用的玻璃大多是硼硅酸玻璃。形状主要采用适 合细胞贴壁生长和显微镜观察的扁平形状。
与此相关的一种方法是盖玻片培养瓶培养， 就是以盖玻片为生长表面，将拟培养的组织、 细胞接种于盖玻片上，然后放进培养瓶中进行 培养。这样具有以下几优点：。 (1)可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养 物的影响。 (2)可以方便地进行显微镜观察、染色等操 作，以及永久保存。 （3）增加了培养瓶的培养面积。
原本为圆形的细胞一经贴壁就迅速 铺展，然后开始有丝分裂，并很快 进入对数生长期。一般数天后就可 铺满生长表面，形成致密的细胞单 层。这种方法易于观察细胞生长状 况，适宜于实验室研究。但是如需 继续培养，需将单层细胞再分散， 稀释后再重新接种，进行传代培养。
组织块也可用两只手术刀片将组织块切 碎，这样对细胞损伤较小，但操作时间 长，容易污染。 对某些软组织如肿瘤、胚眙、脑等可将 碎组织块放人注射器玻璃管中挤压分离。
1、取材分离和组织消化：用生物化学方法将剪碎的组 织分散成细胞团或单细胞。胰蛋白酶，适用于细胞间 质较少的软组织。 2、培养过程： 处死动物 ---- 将组织块剪ห้องสมุดไป่ตู้ Hanks液 冲下 剪刀上的碎块，补加3~5mLHanks液 吹打、低 速离心、弃上清液、留下组织块 :组织消化-----吸管 取出组织液放入培养瓶内，加入培养液 ------ 培养-- 传代
(1)游离期： 接种的细胞在培养液中呈悬浮态，由于细胞质 的回缩，各种形状的细胞都开始变圆。 (2)吸附期： 细胞类型不同，贴壁时间有所差异。单个细胞、 传代细胞较快，组织块、较大细胞团较慢。一 般多数细胞都可在24h内贴壁，平均贴壁时间 大约5-20min。而细胞状态不好及濒死细胞、 培养基偏酸或偏碱、培养瓶不洁等不利条件都 不利于细胞贴壁。
（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖 能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称
毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细 胞计数相同。 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数
用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计算板上，微微移向一侧， 以便滴加细胞悬液. 取一吸管伸入培养瓶，轻轻吹打细胞悬液，混匀。 从盖片边缘滴加细胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中。 注意： 勿使液体漫过盖片或出现气泡。 镜下观察计数： 计算计数板四角大格 内的细胞数，压线者只计算 左侧和上方的,右侧和下方的不计算在内。 按下式计算：
最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任 何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细 胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志
(1)贴壁培养比较容易更换培养基。 (2)容易采用灌注培养，从而达到提高细 胞密度的目的。 (3)更有效地表达同一产品。 (4)可以方便地调节培养液和细胞比例。 (5)易于观察细胞生长状况。
胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为 什么？ 提示：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的 蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜 蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控 制好胰蛋白酶的消化时间。
加消化液得到 分散的单细胞 倒掉消化液 加培养液终止消化 吹打成细胞悬液 接种2-4个培养瓶生长
包括：取材、分散细胞、接种、培养 等． 在所有操作中，多都要注意保持培养物 及生长环境的无菌条件。
组织块的原代培养方法，首先从机体某 部位取下组织，方法： 处死动物 将组织块剪碎 Hanks液 冲下剪刀上的碎块，补加 3~5mLHanks液 吹打、低速离心、 弃上清液、留下组织块 吸管取 出组织块放入培养瓶内，使其贴在瓶壁 上，（有组织块的瓶壁朝上）加入培养 液 培养 传代
培养板培养法曾被称为微量培养法，是 现代体外培养技术最为常用的方法之一。 具体做法是将培养细胞接种在培养板的 孔内，然后在C02培养箱内培养。最常用 的培养板有6孔、24孔和96孔培养板，后 者最为常用。一般都是一次性使用。
幼体比老龄更容易培养，尤其是胚胎组织；分化低 比分化高的容易培养；肿瘤比正常组织容易培养。 任何动物细胞培养均从原代培养开始。 原代培养分为两种：组织块培养法和组织消化培养
贴壁细胞传代-消化过程 1.首先将超净工作台用紫外 光灯照射灭菌20-30分钟；
2. 关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精 灯(一切操作均需在酒精灯火焰下进行)