1、自然杀伤细胞(nature killer ce星空体育 星空体育平台lls，nk)是一种毒性淋巴细胞，在人固有的免疫系统中占据至关重要的作用，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节功能，是机体的第一道免疫屏障。自然杀伤细胞具有强大的细胞毒性，其在被激活后会分泌ifn-γ、穿孔素等效应分子作用于靶细胞，应答迅速且强度高；同时，自然杀伤细胞的杀伤作用无需预先抗原致敏，也不受主要组织相容性复合物分子限制；此外，活化的自然杀伤细胞可合成和分泌多种细胞因子，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。鉴于自然杀伤细胞以上特点，虽然具有很高的应用前景，但是在受限于人外周血中占比较低，只占外周血单核细胞的5-20％。
2、目前体外扩增的方法大体分为三种：(1)滋养层细胞培养法，如采用灭活的k562滋养层细胞，经过2-3周培养，其nk阳性率较高，但灭活的滋养层很星空体育 星空体育平台难去除，存在安全隐患；(2)磁珠分选法，该方法获得的nk具有纯度高、扩增效率高等特点，但磁珠分选的得率较低，费用高；(3)商品化重组因子试剂盒培养法，该方法获得的nk安全性较高，但价格差异较大，同一试剂盒培养的个体差异也较大，通常阳性率在20-80％，稳定性较差，同时会存在较高比例的t细胞。
3、综上，这些方法基本都还存在一定的缺陷，因此提供高效稳定的且易于操作成本相对较低的体外外周血自然杀伤性细胞培养方法是十分必要的。
1、本公开的目的在于提供一种高效稳定、易于操作且成本相对较低的体外培养nk细胞的方法。
2、为了实现上述目的，本公开提供了一种nk细胞的体外扩增方法，该方法包括：
3、s1、将外周血单个核细胞用含有自体血浆和cd3抗体的第一培养基重悬，得到第一细胞悬液；
4、s2、将所述第一细胞悬液接种至培养瓶中，并且进行培养，得到第一培养物；
6、可选地，所述第一培养基含有无血清基础培养基、自体血浆和cd3抗体；所述无血清基础培养基可以是购自于baso的alys505nk-ex无血清培养基、购自于友康的nk细胞无血清培养基5.0等商品化nk细胞无血清培养基；所述自体血浆的含量为5-20体积％，优选为10-20体积％，所述cd3抗体的浓度为25-100ng/ml，优选为25-50ng/ml。
7、可选地，所述第一细胞悬液中外周血单个核细胞的浓度为(3-5)×106个/ml，优选为(4-5)×106个/ml。
8、可选地，所述培养瓶中外周血单个核细胞的接种量为(8-13)×105个/cm2，优选为(10-13)×105个/cm2。
9、可选地，步骤s2中，所述培养的条件包括：将所述培养瓶置于30-40℃、4-6％co2氛围下培养2-4天后，离心后除去上清液，在第二培养基中进行体外诱导扩增培养。
10、可选地，所述第二培养基含有无血清基础培养基和添加剂；所述添加剂为购自于baso的nk cell induction kit或购自于友康生物的nk细胞诱导扩增试剂盒，所述添加剂的含量可以为其产品说明书中所述的含量；所述无血清培养基可以为购自于baso的alys505nk-ex无血清细胞培养基、购自于友康的nk细胞无血清培养基5.0等商品化nk细胞无血清培养基。
11、可选地，所述外周血单个核细胞通过ficoll法分离外周血的下层血细胞得到；
12、所述ficoll法包括：取外周血分离得到的下层血细胞用生理盐水稀释至原外周血体积，平铺至ficoll分离液上，于600-800g下离心15-25min，取其中白膜层细胞离心后弃上清，重悬下层细胞沉淀，于400-600g下离心8-10min弃上清，重复操作2-3次，得到所述外周血单个核细胞。
14、通过上述技术方案，本公开提供了nk细胞的体外扩增方法，利用该方法进行nk细胞的体外扩增培养具有诸多有益效果：(1)本公开首次发现低浓度的cd3单克隆抗体可用于体外扩增cd3-的自然杀伤细胞，与自体血浆联合使用，可提高体外扩增外周血nk比例，且不降低扩增效率和nk细胞的杀伤效率；(2)操作简单，易于推广，解决了现有商品化诱导试剂盒稳定性差的特点，且提高了nk的阳性率；(3)培养过程中成分明确，且成本低，未引入动物源成分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一培养基中cd3抗体的浓度为25-100ng/ml，优选为25-50ng/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一培养基中自体血浆的含量为5-20体积％。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一培养基中自体血浆的含量优选为10-20体积％。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一细胞悬液中外周血单个核细胞的浓度为(3-5)×106个/ml。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第一细胞悬液中外周血单个核细胞的浓度优选为(4-5)×106个/ml。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养瓶中外周血单个核细胞的接种量为(8-13)×105个/cm2，优选为(10-13)×105个/cm2。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤s2中，所述培养的条件包括：将所述培养瓶置于30-40℃、4-6％co2氛围下培养2-4天后，离心后除去上清液，在第二培养基中进行体外诱导扩增培养。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述外周血单个核细胞通过ficoll法分离外周血的下层血细胞得到；
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述自体血浆为外周血经过离心处理后的上层血浆。
本发明提供了一种NK细胞的体外扩增方法，该方法包括：S1、将外周血单个核细胞用含有自体血浆和CD3抗体的第一培养基重悬，得到第一细胞悬液；S2、将所述第一细胞悬液接种至培养瓶中，并且进行培养，得到第一培养物；所述第一培养基中的自体血浆为所述外周血单个核细胞对应的自体血浆。利用该方法进行NK细胞培养能够可提高体外扩增外周血NK比例，且不降低扩增效率和NK细胞的杀伤效率。
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