原代培养期:从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。这个阶段细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。传代期：从原代培养的细胞的一经传代后便称细胞系。细胞增殖旺盛，当传代10-50次后，细胞增殖缓慢，以致完全停止。衰退期：细胞增殖缓慢或不星空体育登录入口 星空体育在线官网增殖。细胞轮廓增强，最后衰退凋亡。PrimaryCulture也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（CloningEfficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（DiploidCellLine）。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。初代培养细胞系（连续细胞系）老化传代期周此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（SpontaneousTransformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（InfiniteCellLine），也称连续细胞系（ContinuousCellLine）。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。包括：取材、分散细胞、接种、培养等．在所有操作中，多都要注意保持培养物及生长环境的无菌条件。组织块的原代培养方法，首先从机体某部位取下组织，方法：处死动物将组织块剪碎Hanks液冲下剪刀上的碎块，补加3~5mLHanks液吹打、低速离心、弃上清液、留下组织块吸管取出组织块放入培养瓶内，使其贴在瓶壁上，（有组织块的瓶壁朝上）加入培养液培养传代组织块也可用两只手术刀片将组织块切碎，这样对细胞损伤较小，但操作时间长，容易污染。对某些软组织如肿瘤、胚眙、脑等可将碎组织块放人注射器玻璃管中挤压分离。1、取材分离和组织消化：用生物化学方法将剪碎的组织分散成细胞团或单细胞。胰蛋白酶，适用于细胞间质较少的软组织。2、培养过程：处死动物----将组织块剪碎Hanks液冲下剪刀上的碎块，补加3~5mLHanks液吹打、低速离心、弃上清液、留下组织块:组织消化-----吸管取出组织液放入培养瓶内，加入培养液------培养---传代接种加入培养基培养（每次换液后更换新的瓶塞）根据细胞生长的特点，传代方法有3种：1．悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。贴壁细胞细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。1.首先将超净工作台用紫外光灯照射灭菌20-30分钟；贴壁细胞传代-消化过程2.关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精灯(一切操作均需在酒精灯火焰下进行)3.4.HeLa；5.用无菌吸管将细胞上原有的培养液吸净，弃去培养液。6.分别取1毫升0.25%胰酶消化液放入培养皿中7.3718.9.细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞从细胞瓶壁上洗下，将细胞悬液用吸管吹散后传代：有经验后，可肉眼对光观察帖壁半透明的细胞层，判断消化程度。10.待细胞完全脱离后，加入适量的含血清的培养基终止反应刚加入胰酶，细胞仍呈致密单层：细胞基本皱缩变圆，此时细胞吹打可下：检查细胞形态及活力：状态良好的细胞应是轮廓不十分清晰，而生长不良的细胞轮廓反而清晰，细胞间隙增大，有空泡、脂滴、颗粒出现，细胞形态不规则。PH新鲜的呈桃红色，PH在7.2-7.4之间。培养一段时间后，PH下降，培养液变黄。ＣＯ ２ 培养箱可自动控制5%ＣＯ ２ 的含 量。 细胞计数 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能 生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每 毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细 胞计数相同。 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数 贴壁生长的细胞一般生长过程是： (1)游离期： 接种的细胞在培养液中呈悬浮态，由于细胞质 的回缩，各种形状的细胞都开始变圆。 (2)吸附期： 细胞类型不同，贴壁时间有所差异。单个细胞、 传代细胞较快，组织块、较大细胞团较慢。一 般多数细胞都可在24h内贴壁，平均贴壁时间 大约5-20min。而细胞状态不好及濒死细胞、 培养基偏酸或偏碱、培养瓶不洁等不利条件都 不利于细胞贴壁。 (3)繁殖期： 圆形悬浮细胞贴壁后延展成极性细胞， 此时虽有细胞运动，却无细胞分裂。经 过一段停滞，开始分裂。随着细胞数量 的增多，细胞间开始接触并连接成片， 这时细胞的运动及分裂都会停止。这种 由于细胞间的接触而发生抑制的现象称 之为接触性抑制。 (4) 细胞长满培养瓶壁达到一定密度后，随 着营养物的消耗和代谢物的积累，细胞 开始退化。细胞轮廓变强，细胞内有膨 胀的线粒体颗粒堆积。如不及时传代， 细胞会从瓶壁上脱下来。 (1)贴壁培养比较容易更换培养基。 (2)容易采用灌注培养，从而达到提高细 胞密度的目的。 (3)更有效地表达同一产品。 (4)可以方便地调节培养液和细胞比例。 (5)易于观察细胞生长状况。 4小时游离细胞 经24小时培养后，生长情况为： 【思考题】 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中， 根据你所学的内环境的知识，思考并讨论以下 问题： 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的 pH和气体环境。 2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？ 提示：无菌、无毒的环境。 gRjUmYp!t&w) z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQi TlXo#s%v( y0B3E 6I 9LdOgRj VmYp !t&w -z1C4G7JaMePh TkWnZr$u* x+A2E 5H8KcNfQiUlXo#s%v) y0B3 F6I 9LdOgSjVmYq! t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZ r$u( x+A2E 5H9KcNf RiUlXp#s&v) y0C3F 6I aLdPgSjVn Yq !t*w -z1D4G8JbMeQhTkWoZ r%u( x+B2E5H9 KcOf RiUmXp#s&v) z0C3F 7I aLdPgSkVn Yq$ t*w- A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u( y+ B2E6H9LcO fRjUmXp !s&v) z0C4F7I aMdPgSk VnZq$ t*x- A1D5G8KbNeQi TlWo#r%v( y+ B3E6H9LcOg RjUmYp!s&w) z1C4 F7JaMdPhSkWnZq$u*x - A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v( y0B3E6I 9LcOgRjVmYp! t&w) z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x +A2D5H8KcNf QiUlXo#s%v) y0 B3F6I 9LdOg RjVmYq! t&w-z1 C4G7JbMePhTkWnZ r$u( x+A2E5H8 KcNf RiUlXp#s%v) y0 C3F6I aLdOgSj VnYq! t*w-z 1D4cNfQiUlXo#s%v( y0 B3F6I 9LdOg RjVmYq! t&w-z1 C4G7JbMePhTkWnZ r$u( x+A2E5H8 KcNf RiUlXp#s%v) y0 C3F6I aLdOgSj VnYq! t*w- z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u( x+ B2E5H9KcNf RiUmXp#s&v) y0C3F 7I aLdPgSjVn Yq$ t*w- A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u( y+ B2E6H9KcO f RjUmXp!s&v) z0C3F7I aMdP gSkVn Yq$ t*x- A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u( y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w) z0C4F7JaMdPhSkVn Zq$u*x -A2D5G8KbNeQi TlXo #r%v( y+ B3E6I 9LcOg RjUmYp! t&w) z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x +A2D5H8KbN fQiUlXo#s%v( y0 B3F6I 9LdOg RjVmYp! t&w-z1 C4G7JaMePhTkWnZ r$u*x+ A2E5H8KcN fQiUlXp#s%v) y0B3F6I aLdOgSj VmYq !t* w-z1D4G7JbMeQhTkWoZ r$u( x+B2E 5H9KcNf RiUlXp#s&v) y0C3F 6I aLdPgSjVn Yq !t*w - A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u( x+ B2E6H9KcO f RiUmXp!s&v) z0C3F 7I aMdPgSkVn Yq$ t*w- A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u( y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w) z0C4F7I aMdPhSkVnZq$t*x - A2D5G8KbNeQiTl Xo# r%v( y+B3E 6I 9LcOgRjUmYp !s&w) z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u* x- A2D5H8KbNfQi TlXo#s%v( y0B3E 6I 9LdOgRj VmYp !t&w -z1C4G7JaMePh TkWnZr$u* x+A2D5H8KcN fQiUlXo#s%v) y0B3F6I 9LdOgSj VmYq !t&w -z1D4G7JbMePhTkWoZr$u( x+ A2E5H9KcN fRi Yp! t&w-z1 C4G7JaMePhSkWnZr $u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo# s%v) y0B3F6I 9LdOgSj VmYq ! t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr $u( x+A2E5H9 KcNfRiUl Xp#s%v) y0 C3F6I aLdOgSj VnYq !t *w-
肝细胞生长因子对体外培养大鼠肝星状细胞增殖和凋亡影响及其抗纤维化作用机制的研究
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