1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种用于高效扩增rna病毒的重组细胞及其扩增方法和应用。
2.rna病毒，如冠状病毒、流感病毒等引起的恶性传染病严重危害人类生命健康。对这些恶性传染病毒的感染机制、生物学特性研究以及高效抗病毒药物研发成为研究热点，而分离并高效扩增病毒成为科研、药物筛选以及疫苗开发的基础。因此，病毒的高效增殖成为重要的关键环节。扩增病毒主要有：动物接种、鸡胚接种和细胞培养法。动物接种法的范围有限，且可能会与动物体内潜在病毒混淆；鸡胚接种往往不能产生特异性的感染指标，同样受限于可接种的病毒范围和规模；而细胞的培养可以人为控制，样本比较均一，具有很强的试用性。目前常用星形胶质瘤细胞系dbt-1、非洲绿猴肾细胞vero和人肺癌细胞系a549等作为体外病毒感染筛选药物、疫苗开发的平台细胞。
3.为进一步提高这些细胞的病毒扩增能力，我们可以通过基因编辑技术对平台细胞进行改造。体外培养的细胞同样存在先天性免疫应答，而这个免疫的存在会影响病毒的进一步繁殖；同时，免疫应答能够介导细胞发生死亡(主要形式为细胞凋亡)，同样影响了最终的病毒复制。根据调研，我们发现抑癌基因p53在病毒的感染过程中发挥着重要的作用和功能。该基因编码的蛋白具有广泛而重要的生物学作用，调控着细胞周期、细胞凋亡、维持基因组稳定和抑制病毒感染等进程。在抗病毒感染过程中，p53可以调控各种免疫调节基因，包括tlr3、irf9、irf5、pkr和isg15等。因此，p53成为高效扩增病毒的潜在靶基因。
4.目前，基因编辑技术发展十分迅速，尤其是crispr-cas9核酸酶系统具有更加高效、快速的基因编辑特点。在特异性向导rna的作用下，cas9核酸酶可以在特定的位置进行切割dna双链，形成双链断裂(dsb)，随后利用同源定向修复或非同源末端连接的修复方法对感兴趣的片段进行编辑，从而产生基因敲除或突变。
5.基于以上内容，我们利用crispr-cas9技术对病毒扩增细胞中的p53基因进行敲除，以构建出进一步高效扩增病毒的平台细胞。因此，提出一种用于高效扩增rna病毒的重组细胞及其扩增方法和应用。
6.本发明的目的在于，提供一种基于crispr-ca星空体育 星空体育平台s9编辑技术的高效扩增病毒的方法，并拓展其在高效扩增病毒中的应用。
8.本发明提供了一种用于高效扩增rna病毒的重组细胞，所述重组细胞为将线基因失活后制备获得的一种p53基因表达缺失的线.进一步改进在于，所述真核细胞为vero细胞或dbt-1细胞。
10.进一步改进在于，所述重组细胞为p53基因的第4外显子序列发生突变，所述第4外
显子序列包括如seq id no.1所示核苷酸序列，所述突变为seq id no.1所示核苷酸序列中发生至少1个碱基的缺失或增加。
11.进一步改进在于，所述突变为seq id no.1所示核苷酸序列被编辑为如seq id no.2-4任一所示的序列。
12.进一步改进在于，通过基因敲除手段使线基因失活，所述基因敲除手段采用crispr-cas9技术，步骤包括：
13.(1)以线基因外显子编码区为模版，根据crispr-cas9技术要求和序列同源性比对分析，设计特异性靶向的sgrna序列；
14.(2)根据所述sgrna序列合成敲除p53的双链dna，并连接至pspcas9(bb)-2a-puro质粒上获得重组质粒；
16.(4)经过加压筛选和有限稀释法，获得敲除p53的单克隆细胞，即为所述重组细胞。
agtgaagccctccgagtgtc-3’，所述步骤(2)双链dna的序列为oligo1：5
caccgcctcgagctccctctgagcc-3’；oligo2：5
18.本发明还提供了一种利用上述重组细胞高效扩增rna病毒的方法，利用病毒去感染所述重组细胞，用以提高该病毒的滴度，实现高效扩增。
21.本发明还提供了一种如上述重组细胞在高效扩增rna病毒、及其在生产和研发该rna病毒类疫苗中的应用。
23.本发明通过在真核细胞中通过基因敲除手段获得p53失活的重组细胞，在该细胞中感染病毒后可以提高相应病毒的滴度，能被显著提高滴度的病毒可以为vsv、ndv或其它rna病毒，可用于相应疫苗的研发和生产过程。
25.图2为4种sgrna表达质粒转染dbt-1细胞后p53表达情况。
33.下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施
方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术作出一些非本质的改进和调整。
35.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明均为常规生化方法。下述实施例中所用的试验材料如无特殊说明均为常规生化试剂商店购买所得。
36.pspcas9(bb)-2a-puro载体购自addgene(目录号：px459)；
37.dbt-1细胞：由军事科学院军事医学研究院惠赠，也可通过市售途径购买获得；
38.opti-mem i medium:gibco(目录号：31985-070)；
40.嘌呤霉素：gene operation公司(目录号：isy1130-0025mg)；
42.pspax2载体、pcs-cg载体和pmd2.g载体：由安徽大学物质科学与信息技术研究院秦曦明教授惠赠，也可通过市售途径购买获得；
43.新城疫病毒ndv、水疱性口炎病毒vsv：由军事科学院军事医学研究院惠赠，也可通过市售途径购买获得。
48.dbt-1细胞中p53基因【ncbi登录号:22059】的开放阅读框包含12个外显子，根据crispr-cas9技术要求和序列同源性比对分析，筛选并设计了4种sgrna(sgrna1-4)，sgrna1靶向外显子1，sgrna2和sgrna3同时靶向外显子4而sgrna4靶向外显子5。四种sgrna的靶标序列如下表1所示，在p53外显子上的位置如结果图1所示。
)sgrna1cctcgagctccctctgagccsgrna2agtgaagccctccgagtgtcsgrna3tccgagtgtcaggagctcctsgrna4cagcgtggtggtaccttatg
52.分别合成表1中的dna序列及其互补配对序列，构建sgrna的寡聚核苷酸双链d na序列见表2。退火后形成两端均具有粘性末端的双链dna分子，经bpil酶切后连接至载体pspcas9(bb)-2a-puro上，得到4种重组质粒(pspcas9(bb)-2a-puro-sgrna1，pspcas9(bb)-2a-puro-sgrna2，pspcas9(bb)-2a-puro-sgrna3和pspcas9(bb)-2a-pur o-sgrna4)。
(2)弃去培养基，更换为新鲜完全培养液。分别在4个ep管中依次加入125μl opti-mem、2.5μg上述4种重组质粒后轻轻吹打混匀。再加入4μl lipo 8000转染试剂轻轻吹打混匀，室温孵育5分钟。最后将质粒和转染试剂的混合液逐滴加入6孔板中，12小时后更换为新鲜的完全培养基继续孵育。
(3)24小时后，弃去培养基并用pbs缓冲液洗涤细胞3次，更换含有嘌呤霉素的新鲜培养基进行筛选。1周后收集部分细胞进行免疫印迹检测p53蛋白和内参蛋白gap dh表达情况，结果见图2。从结果图中可以看出转染pspcas9(bb)-2a-puro-sgrna2质粒后细胞中p53的表达显著减弱。
进一步筛选pspcas9(bb)-2a-puro-sgrna2稳定表达细胞株。经过3轮加压筛选和有限稀释法筛选后最终获得了3种敲除p53的单克隆细胞，免疫印迹结果见图3。提取细胞基因组后pcr扩增包含sgrna2靶标区域的p53基因组序列，pcr扩增引物5
测序后通过比对发现p53第4个外显子中相应序列被编辑为序列2、3和4中的序列，相比较seq id no.1所示的dbt-1细胞原始序列，发生了碱基的缺失或增加，序列2、3、4分别如序列表中seq id no.2-4所示。
获得敲除细胞后，进行细胞增殖速度和抗凋亡检测。接种6000-8000个/孔的对照细胞和敲除细胞于96孔板中进行正常培养，24小时后进行mtt检测，获得到结果图4，可以看出敲除细胞的增殖速度较快；将细胞计数后按照1
105cells/ml接种到6孔板中培养24小时，实验组加入3μg/ml的顺铂或无血清的dmem进行饥饿处理。48小时后用预冷的pbs漂洗细胞两次，然后加入100μl 1
binding buffer重悬细胞。随后加入5μl fitc-annexinv和5μl pi进行避光染色15分钟，补加300μl1
获得到结果图5，可以看出，无论是凋亡诱导剂顺铂处理还是无血清的饥饿处理，敲除细胞均表现出显著的抗凋亡作用。
进一步，用慢病毒感染细胞进行感染检测。包装慢病毒大体方法步骤为：接种293t细胞于10cm皿中，24小时后将完全培养基更换为基础培养基。将质粒用基础培养基按比例(pcs-cg:pspax2:pmd2.g＝4:3:1)稀释后缓慢吹打混匀，lipo 8000转染试剂用基础培养基稀释后滴加到质粒混合液中，轻轻混匀静置20分钟。均匀的滴加到细胞培养皿中，继续培养6-8小时后将培养基更换为完全培养基。分别在48和72小时后置于荧光显微镜下观察绿色荧光强度并收集培养液于无菌离心管中。将收集的细胞培养液进行离心过滤静置过夜，离心弃上清后用基础培养基重悬沉淀获得浓缩病毒液。
106个/孔dbt-1细胞于6孔板中，第二天观察细胞密度至70％左右时进行感染。病毒液用完全培养基按1：50稀释进行细胞感染，24小时后换液，48小时后在荧光显微镜下收集细胞用流式细胞仪检测荧光强度，获得结果图6，从结果中可以看出敲除基因p53后可以显著促进慢病毒的增殖。
获得p53敲除细胞后，利用ndv-gfp病毒去感染细胞，该病毒是在ndv病毒基因组中插入绿色荧光蛋白(gfp)基因构建了表达重组ndv后，通过检测绿色荧光蛋白的表达情况来进行验证，大体步骤为：接种1
106个/孔dbt-1细胞于6孔板中，第二天细胞密度至70％左右时，用完全培养基按1：800稀释ndv-gfp病毒液进行感染细胞。感染6小时后进行换液，12小时后在荧光显微镜下观察荧光表达情况或者收集细胞用免疫印迹实验检测gfp蛋白和内参蛋白β-tubulin的表达情况，获得结果图7和图8，从结果中可以看出敲除p53后可以显著促进ndv-gfp病毒的增殖。
同上，利用vsv病毒感染细胞，由于g蛋白是该病毒的主要表面抗原因此可以通过检测vsv-g蛋白的表达情况进行星空体育 星空体育平台验证，大体步骤为：接种1
106个/孔dbt-1细胞于6孔板中，第二天细胞密度至约70％左右，用完全培养基按1：1500稀释vsv病毒液进行感染细胞。感染3小时后进行换液，18小时后收集细胞用免疫印迹实验检测vsv-g蛋白和内参蛋白gapdh的表达情况，获得结果图9，从结果中可以看出敲除p53后同样可以促进病毒的增殖。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
如您需求助技术专家，请点此查看客服电线.CRISPR-Cas系统 2.基因编辑 3.基因修复 4.天然产物合成 5.单分子技术开发与应用
1.探索新型氧化还原酶结构-功能关系，电催化反应机制 2.酶电催化导向的酶分子改造 3.纳米材料、生物功能多肽对酶-电极体系的影响4. 生物电化学传感和生物电合成体系的设计与应用。
1.环境纳米材料及挥发性有机化合物（VOCs）染物的催化氧化 3.低温等离子体 4.吸脱附等控制技术
1.高分子材料改性及加工技术 2.微孔及过滤材料 3.环境友好高分子材料
1.高分子材料的共混与复合 2.涉及材料功能化及结构与性能的研究； 高分子热稳定剂的研发