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本发明公开了一种人Vγ9Vδ2T细胞扩增方法与培养基。本发明通过在人Vγ9Vδ2T细胞的扩增培养过程中添加白介素‑15和维生素C，与传统的扩增方法相比，能够提高人Vγ9Vδ2T细胞的增殖效率与细胞纯度，培养得到的人Vγ9Vδ2T细胞同时抗凋亡能力较强，细胞的存活时间较长的抗凋亡能力更强，细胞存活时间更长，并且关键杀伤分子NKG2D的表达水平更高，从而对肿瘤细胞的杀伤能力更强。
1.一种人Vγ9Vδ2T细胞扩增方法，其特征在于，包括：步骤1、从人体外周血中提取外周血单个核细胞；步骤2、提供人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基，采用所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基对所述外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基包括人Vγ9Vδ2T细胞培养基以及添加于所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基中的膦酸类化合物；所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基包括基础培养基以及添加于所述基础培养基中的白介素-2、白介素-15以及维生素C；所述步骤1与步骤2的顺序可调；步骤3、将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中培养60-100小时；步骤4、采用所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基进行换液，后续培养过程均采用所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基进行。 2.如权利要求1所述的人Vγ9Vδ2T细胞扩增方法，其特征在于，所述基础培养基为RPMI-1640培养基；所述膦酸类化合物包括唑来膦酸、依替膦酸、伊班膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、米罗磷酸中的一种或多种。 3.如权利要求1所述的人Vγ9Vδ2T细胞扩增方法，其特征在于，所述步骤2中，所述细胞悬液的细胞密度为3～4×10个/ml。 4.如权利要求1所述的人Vγ9Vδ2T细胞扩增方法，其特征在于，所述步骤2中，所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基中，膦酸类化合物的浓度为1-1000μM；所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基与所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基中，白介素-2的浓度为1-1000ng/ml，白介素-15的浓度为1-1000ng/ml，维生素C的浓度为10μM-800mM。 5.如权利要求1所述的人Vγ9Vδ2T细胞扩增方法，其特征在于，所述细胞培养容器为24孔板、48孔板或96孔板；所述步骤3中，将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中培养72小时；所述步骤4的后续培养过程中，每隔48-72小时对细胞进行换液。 6.一种人Vγ9Vδ2T细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基以及添加于所述基础培养基中的白介素-2、白介素-15以及维生素C。 7.如权利要求6所述的人Vγ9Vδ2T细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为RPMI-1640培养基。 8.如权利要求6所述的人Vγ9Vδ2T细胞培养基，其特征在于，所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基中，白介素-2的浓度为1-1000ng/ml，白介素-15的浓度为1-1000ng/ml，维生素C的浓度为10μM-800mM。 9.一种人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基，其特征在于，包括如权利要求6至8任一项所述的人Vγ9Vδ2T细胞培养基以及添加于所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基中的膦酸类化合物。 10.如权利要求9所述的人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基，其特征在于，所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基中，膦酸类化合物的浓度为1-1000μM。
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种人Vγ9Vδ2T细胞扩增方法与培养基。
免疫细胞治疗已成为全世界医疗领域内对难治性疾病(如恶性肿瘤)进行治疗的新的重要医疗手段，比如采用CAR-T细胞对B细胞淋巴瘤进行治疗。对科学界和医疗界而言，获得质量稳定可靠、功能优良的免疫细胞对获得良好的临床治疗效果非常关键。
人Vγ9Vδ2T细胞是仅存在于灵长类和人中的一类具有抗肿瘤、抗感染功能的T细胞亚群。人Vγ9Vδ2T细胞可用于患有肿瘤、难治性传染病及免疫功能失衡疾病的人群的免疫细胞治疗或免疫功能重建。
第一类现有扩增技术是在外周血单核细胞(PBMCs)的培养基中添加IL-2和TCRγδ的单克隆抗体。这种方法的主要缺点是外周血中的两类γδT细胞(Vδ1细胞亚群和Vδ2细胞亚群)都被扩增，而Vδ1细胞亚群具有免疫抑制功能，因此不适用于免疫细胞治疗。
第二类现有扩增技术是在PBMCs的培养基中添加IL-2和磷酸盐小分子化合物如唑来膦酸。这种方法可以得到纯度较高的Vδ2亚群的γδT细胞，可以用于免疫细胞治疗，这是目前国内外扩增人外周血人Vγ9Vδ2T细胞的常用方法。但是该方法的缺点是：细胞培养扩增的周期为14天左右，扩增出来的人Vγ9Vδ2T细胞的存活时间较短(能继续存活7天左右)，细胞抗凋亡能力不强，对肿瘤细胞的杀伤能力不强等。
本发明的目的首先在于提供一种人Vγ9Vδ2T细胞扩增方法，能够提高人Vγ9Vδ2T细胞的增殖效率与细胞纯度，培养得到的人Vγ9Vδ2T细胞具有较强的肿瘤杀伤能力及抑制能力，同时抗凋亡能力较强，细胞的存活时间较长。
本发明的目的还在于提供一种人Vγ9Vδ2T细胞培养基，采用该培养基对人Vγ9Vδ2T细胞进行培养，能够提高人Vγ9Vδ2T细胞的增殖效率与细胞纯度，培养得到的人Vγ9Vδ2T细胞具有较强的肿瘤杀伤能力及抑制能力，同时抗凋亡能力较强，细胞的存活时间较长。
本发明的目的还在于提供一种人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基，能够从外周血单个核细胞中选择性的扩增出人Vγ9Vδ2T细胞，扩增得到的人Vγ9Vδ2T细胞的纯度高，杀伤能力与抗凋亡能力较强。
步骤2、提供人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基，采用所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基对所述外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；
所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基包括人Vγ9Vδ2T细胞培养基以及添加于所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基中的膦酸类化合物；所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基包括基础培养基以及添加于所述基础培养基中的白介素-2、白介素-15以及维生素C；
步骤4、采用所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基进行换液，后续培养过程均采用所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基进行。
可选的，所述基础培养基为RPMI-1640培养基；所述膦酸类化合物包括唑来膦酸、依替膦酸、伊班膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、米罗磷酸中的一种或多种。
可选的，所述步骤2中，所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基中，膦酸类化合物的浓度为1-1000μM；
所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基与所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基中，白介素-2的浓度为1-1000ng/ml，白介素-15的浓度为1-1000ng/ml，维生素C的浓度为10μM-800mM。
可选的，所述细胞培养容器为24孔板、48孔板或96孔板；所述步骤3中，将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中培养72小时；所述步骤4的后续培养过程中，每隔48-72小时对细胞进行换液。
本发明还提供一种人Vγ9Vδ2T细胞培养基，包括基础培养基以及添加于所述基础培养基中的白介素-2、白介素-15以及维生素C。
本发明还提供一种人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基，包括人Vγ9Vδ2T细胞培养基以及添加于所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基中的膦酸类化合物。
可选的，所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基中，膦酸类化合物的浓度为1-1000μM。
(1)与传统的扩增方法(第二类扩增技术)相比，本发明的扩增方法中人Vγ9Vδ2T细胞的增殖效率更快且细胞纯度更高，在(从步骤3开始)培养10-12天时，即可达到90％的细胞纯度，细胞扩增比率达到1000倍以上(即能够将10万个人Vγ9Vδ2T细胞扩增至至少一亿个人Vγ9Vδ2T细胞)，显著缩短了人Vγ9Vδ2T细胞扩增培养周期；
(2)与传统的扩增方法(第二类扩增技术)得到的人Vγ9Vδ2T细胞相比，本发明扩增得到的人Vγ9Vδ2T细胞对肿瘤的杀伤及抑制能力更强；
(3)本发明扩增得到的人Vγ9Vδ2T细胞的抗凋亡能力更强，存活时间更长，并且，在细胞扩增培养周期(从步骤3开始10-12天)结束后，本发明扩增得到的人Vγ9Vδ2T细胞能继续存活约20天。
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。
图1为采用四种不同的培养基对人Vγ9Vδ2T细胞进行扩增培养的增殖效率对比图；
图2为采用四种不同的培养基对人Vγ9Vδ2T细胞进行扩增培养后得到的人Vγ9Vδ2T细胞的凋亡率对比图；
图3为采用四种不同的培养基对人Vγ9Vδ2T细胞进行扩增培养后得到的人Vγ9Vδ2T细胞的关键杀伤分子NKG2D表达水平对比图；
图4A为采用传统的扩增方法(IL2)得到的人Vγ9Vδ2T细胞对肺癌人源化小鼠进行细胞治疗后的肿瘤大小示意图；
图4B为采用本发明的扩增方法(IL2+IL15+VC)得到的人Vγ9Vδ2T细胞对肺癌人源化小鼠进行细胞治疗后的肿瘤大小示意图；
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的星空体育 星空体育平台质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)；
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
步骤2、提供人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基，采用所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基对所述外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；
所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基包括人Vγ9Vδ2T细胞培养基以及添加于所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基中的膦酸类化合物；所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基包括基础培养基以及添加于所述基础培养基中的白介素-2(IL-2)、白介素-15(IL-15)以及维生素C(Vitamin C)。
步骤4、采用所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基进行换液，后续培养过程均采用所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基进行。
具体的，所述步骤1中，所述基础培养基为RPMI-1640培养基。RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维·帕克纪念研究所。RPMI是该研究所研发的一类细星空体育 星空体育平台胞培养基，1640是培养基代号，其中含有10％胎牛血清。
可选的，所述膦酸类化合物包括唑来膦酸(Zoledronate,ZOL)、依替膦酸、伊班膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、米罗磷酸中的一种或多种。
具体的，所述步骤2与步骤3的目的在于：通过采用含有膦酸类化合物的人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基对所述外周血单个核细胞进行培养，选择性的对所述外周血单个核细胞中的Vγ9Vδ2T细胞进行扩增，并且抑制其它细胞的生长，使其它细胞凋亡。
所述步骤4的目的在于对所述步骤3选择性扩增出的纯度较高的Vγ9Vδ2T细胞进行进一步扩增，以增加Vγ9Vδ2T细胞的数量。
具体的，所述步骤2中，所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基中，膦酸类化合物的浓度为1-1000μM；
所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基与所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基中，白介素-2的浓度为1-1000ng/ml，白介素-15的浓度为1-1000ng/ml，维生素C的浓度为10μM-800mM。
具体的，所述步骤3与步骤4的总培养时间通常为10-12天，这个时间点的细胞数量充足并且杀伤能力最强，尤其适用于进行细胞治疗。
本发明的人Vγ9Vδ2T细胞扩增方法中，未注明具体条件的操作方法均按常规条件(如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004))中所述的方法进行。
本发明的关键技术特征在于在细胞培养过程中白介素-15和维生素C的使用，通过在人Vγ9Vδ2T细胞的扩增培养过程中添加白介素-15和维生素C，与传统的扩增方法(第二类扩增技术)相比，能够提高人Vγ9Vδ2T细胞的增殖效率与细胞纯度，培养得到的人Vγ9Vδ2T细胞的抗凋亡能力更强，细胞存活时间更长，并且关键杀伤分子NKG2D的表达水平更高，从而对肿瘤细胞的杀伤能力更强。相对于现有的第二类扩增技术(详见背景技术介绍)来说，本发明解决了比如扩增效率低及纯度低的问题、所获得细胞的杀伤功能不强的问题以及所获得细胞存活时间不够、易衰老、易凋亡等技术问题。
(1)与传统的扩增方法(第二类扩增技术)相比，本发明的扩增方法中人Vγ9Vδ2T细胞的增殖效率更快且细胞纯度更高，在(从步骤3开始)培养10-12天时，即可达到90％的细胞纯度，细胞扩增比率达到1000倍以上(即能够将10万个人Vγ9Vδ2T细胞扩增至至少一亿个人Vγ9Vδ2T细胞)，显著缩短了人Vγ9Vδ2T细胞扩增培养周期；
(2)与传统的扩增方法(第二类扩增技术)得到的人Vγ9Vδ2T细胞相比，本发明扩增得到的人Vγ9Vδ2T细胞对肿瘤的杀伤及抑制能力更强；
(3)本发明扩增得到的人Vγ9Vδ2T细胞的抗凋亡能力更强，存活时间更长，并且，在细胞扩增培养周期(从步骤3开始10-12天)结束后，本发明扩增得到的人Vγ9Vδ2T细胞能继续存活约20天。
基于上述人Vγ9Vδ2T细胞扩增方法，本发明还提供一种人Vγ9Vδ2T细胞培养基，包括基础培养基以及添加于所述基础培养基中的白介素-2、白介素-15以及维生素C。
本发明还提供一种人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基，包括如上文所述的人Vγ9Vδ2T细胞培养基以及添加于所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基中的膦酸类化合物。
可选的，所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基中，膦酸类化合物的浓度为1-1000μM。
图1为采用四种不同的培养基对人Vγ9Vδ2T细胞进行扩增培养的增殖效率对比图。
图1中，IL2表示整个扩增培养过程中采用的是在基础培养基的基础上添加IL2+IL15后得到的培养基；
IL2+VC表示整个扩增培养过程中采用的是在基础培养基的基础上添加IL2+VC后得到的培养基；
IL2+IL15表示整个扩增培养过程中采用的是在基础培养基的基础上添加IL2+IL15后得到的培养基；
IL2+IL15+VC表示整个扩增培养过程中采用的是在基础培养基的基础上添加IL2+IL15+VC后得到的培养基；
在前期的刺激扩增阶段(步骤2与步骤3)，上述四种培养基方案中均添加ZOL。
如图1所示，采用上述四种培养基分别对人Vγ9Vδ2T细胞进行扩增培养后，得到的数据显示，没有添加IL15的培养基(IL2与IL2+VC)的细胞增殖效率较低，而添加了IL15的培养基(IL2+IL15与IL2+IL15+VC)的细胞增殖效率较高，由此可以看出，IL-15的添加能够显著提高人Vγ9Vδ2T细胞的增殖效率(Ki67蛋白表达上升)。
图2为采用四种不同的培养基对人Vγ9Vδ2T细胞进行扩增培养后得到的人Vγ9Vδ2T细胞的凋亡率对比图，图2中IL2、IL2+VC、IL2+IL15、IL2+IL15+VC表示的含义与图1相同。
从图2中可以看出，在培养基中添加VC能够显著降低细胞的凋亡比例和凋亡速度，另外，IL-15与VC联用能够更加显著的增强细胞抗凋亡能力。
图3为采用四种不同的培养基对人Vγ9Vδ2T细胞进行扩增培养后得到的人Vγ9Vδ2T细胞的关键杀伤分子NKG2D表达水平对比图，图3中IL2、IL2+VC、IL2+IL15、IL2+IL15+VC表示的含义与图1、图2相同。
从图3中可以看出，IL-15与维生素C的联用能够使人Vγ9Vδ2T细胞的关键杀伤分子NKG2D持续维持高水平表达，并且在培养21天及以后仍然维持在高水平表达。换言之，IL-15与VC联用的配方(即本发明的技术方案)能够使人Vγ9Vδ2T细胞的高杀伤能力维持更长时间。
本实验为治疗模型，首先构建人源化小鼠，即在小鼠体内构建人的外周免疫系统，从而模拟人体生理状态。然后将10万个A549癌细胞通过皮下注射至小鼠体内，待肿瘤细胞生长7天，在小鼠体内长出肿瘤。然后利用培养好的人Vγ9Vδ2T细胞进行治疗，每三天通过尾静脉注射细胞治疗一次，连续治疗5次，每次打细胞数量为5*10^6个细胞，然后定期观察小鼠的肿瘤生长情况，并记录小鼠的存活率。总观察时间为90天，之后按伦理要求处死小鼠，取肿瘤块进行测量、分析等。
图4A为采用传统的扩增方法(IL2)得到的人Vγ9Vδ2T细胞对肺癌人源化小鼠进行细胞治疗后的肿瘤大小示意图。
所述传统的扩增方法(即第二类扩增技术)即为在基础培养基中始终加入IL2进行培养，并且在培养的前期阶段添加ZOL进行刺激性扩增。
图4B为采用本发明的扩增方法(IL2+IL15+VC)得到的人Vγ9Vδ2T细胞对肺癌人源化小鼠进行细胞治疗后的肿瘤大小示意图。
图4A、图4B、图4C的实验中使用的肺癌人源化小鼠为肿瘤类型相同、肿瘤体积基本相同的小鼠，并且图4A、图4B、图4C中展示的肿瘤的生长时间相同。
通过对4A、图4B、图4C进行对比可以看出，采用本发明的扩增方法得到的人Vγ9Vδ2T细胞对肺癌人源化小鼠进行细胞治疗后，证明与传统的扩增方法得到的人Vγ9Vδ2T细胞相比，本发明扩增得到的人Vγ9Vδ2T细胞能够更加有效的抑制肺癌细胞的生长(肿瘤的体积明显缩小)，并且能够显著提高肺癌人源化小鼠的生存率。在第42天时，采用传统的扩增方法得到的人Vγ9Vδ2T细胞进行细胞治疗的肺癌人源化小鼠以及未经治疗的肺癌人源化小鼠已全部死亡，而采用本发明的扩增方法得到的人Vγ9Vδ2T细胞进行细胞治疗的肺癌人源化小鼠全部存活，存活率为100％，并且其中一只小鼠的肿瘤完全消失(图4B方框所示)。
图5为在不同的治疗情况下肺癌人源化小鼠的肿瘤体积变化示意图，图5分别展示了采用传统的扩增方法(IL2)得到的人Vγ9Vδ2T细胞对肺癌人源化小鼠进行细胞治疗、采用本发明的扩增方法(IL2+IL15+VC)得到的人Vγ9Vδ2T细胞对肺癌人源化小鼠进行细胞治疗以及未经治疗的肺癌人源化小鼠的肿瘤体积变化情况。
可以看出，随着时间的增加，采用传统的扩增方法(IL2)得到的人Vγ9Vδ2T细胞治疗的肺癌人源化小鼠以及未经治疗的肺癌人源化小鼠的肿瘤体积不断增加并且在后期肿瘤体积增加速度非常快，而采用本发明的扩增方法(IL2+IL15+VC)得到的人Vγ9Vδ2T细胞治疗的肺癌人源化小鼠的肿瘤体积的增加速度非常缓慢，也即是说，与传统的扩增方法(IL2)得到的人Vγ9Vδ2T细胞相比，本发明的扩增方法(IL2+IL15+VC)得到的人Vγ9Vδ2T细胞对肿瘤的体内生长具有更强的抑制作用，使得肿瘤体积更小。
图6为在不同的治疗情况下肺癌人源化小鼠的存活率变化示意图，图6分别展示了采用传统的扩增方法(IL2)得到的人Vγ9Vδ2T细胞对肺癌人源化小鼠进行细胞治疗、采用本发明的扩增方法(IL2+IL15+VC)得到的人Vγ9Vδ2T细胞对肺癌人源化小鼠进行细胞治疗以及未经治疗的肺癌人源化小鼠的存活率变化情况。
可以看出，随着时间的增加，采用传统的扩增方法(IL2)得到的人Vγ9Vδ2T细胞治疗的肺癌人源化小鼠以及未经治疗的肺癌人源化小鼠的存活率下降非常快，采用本发明的扩增方法(IL2+IL15+VC)得到的人Vγ9Vδ2T细胞治疗的肺癌人源化小鼠的存活率一直为100％，也即是说，采用本发明的扩增方法(IL2+IL15+VC)得到的人Vγ9Vδ2T细胞能够显著提高肺癌人源化小鼠的生存率。
下面以具体实施例的形式对本发明的人Vγ9Vδ2T细胞培养基与人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基进行详细描述。
该实施例1提供一种人Vγ9Vδ2T细胞培养基，包括RPMI-1640培养基以及添加于所述RPMI-1640培养基中的白介素-2、白介素-15以及维生素C。
其中，所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基中，白介素-2的浓度为300ng/ml，白介素-15的浓度为500ng/ml，维生素C的浓度为100mM。
该实施例2提供一种人Vγ9Vδ2T细胞培养基，包括RPMI-1640培养基以及添加于所述RPMI-1640培养基中的白介素-2、白介素-15以及维生素C。
其中，所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基中，白介素-2的浓度为500ng/ml，白介素-15的浓度为700ng/ml，维生素C的浓度为300mM。
该实施例3提供一种人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基，包括如实施例1所述的人Vγ9Vδ2T细胞培养基以及添加于所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基中的唑来膦酸。
其中，所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基中，唑来膦酸的浓度为300μM。
该实施例4提供一种人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基，包括如实施例2所述的人Vγ9Vδ2T细胞培养基以及添加于所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基中的唑来膦酸。
其中，所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基中，唑来膦酸的浓度为500μM。
由于本发明中所涉及的各工艺参数的数值范围在上述实施例中不可能全部体现，但本领域的技术人员完全可以想象到只要落入上述该数值范围内的任何数值均可实施本发明，当然也包括若干项数值范围内具体值的任意组合。此处，出于篇幅的考虑，省略了给出某一项或多项数值范围内具体值的实施例，此不应当视为本发明的技术方案的公开不充分。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式选择等，落在本发明的保护范围内。
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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 0.2 (22)申请日 2018.12.24 (71)申请人 广东暨德康民生物科技有限责任公 司 地址 510000 广东省广州市广州国际生物 岛螺旋四路1号办公区第二层205单元 (72)发明人 尹芝南吴扬哲徐艳 (74)专利代理机构 北京超凡志成知识产权代理 事务所(普通合伙) 11371 代理人 王术兰 (51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) (54)发明名称 人V9V2T细胞扩增方法与培养基 (57)摘要 本发明公开了一种人。
2、V9V2T细胞扩增方 法与培养基。 本发明通过在人V9V2T细胞的 扩增培养过程中添加白介素-15和维生素C， 与传 统的扩增方法相比， 能够提高人V9V2T细胞 的增殖效率与细胞纯度， 培养得到的人V9V 2T细胞同时抗凋亡能力较强， 细胞的存活时间较 长的抗凋亡能力更强， 细胞存活时间更长， 并且 关键杀伤分子NKG2D的表达水平更高， 从而对肿 瘤细胞的杀伤能力更强。 权利要求书1页 说明书8页 附图4页 CN 109337870 A 2019.02.15 CN 109337870 A 1.一种人V9V 2T细胞扩增方法， 其特征在于， 包括： 步骤1、 从人体外周血中提取外周血单个核细。
3、胞； 步骤2、 提供人V9V 2T细胞刺激扩增培养基， 采用所述人V9V 2T细胞刺激扩增培养 基对所述外周血单个核细胞进行重悬， 得到细胞悬液； 所述人V9V 2T细胞刺激扩增培养基包括人V9V 2T细胞培养基以及添加于所述人V 9V 2T细胞培养基中的膦酸类化合物； 所述人V9V 2T细胞培养基包括基础培养基以及 添加于所述基础培养基中的白介素-2、 白介素-15以及维生素C； 所述步骤1与步骤2的顺序可调； 步骤3、 将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中培养60-100小时； 步骤4、 采用所述人V9V 2T细胞培养基进行换液， 后续培养过程均采用所述人V9V 2T细胞培养基进行。 2.如。
4、权利要求1所述的人V9V2T细胞扩增方法， 其特征在于， 所述基础培养基为 RPMI-1640培养基； 所述膦酸类化合物包括唑来膦酸、 依替膦酸、 伊班膦酸、 帕米膦酸、 阿仑 膦酸、 利塞膦酸、 米罗磷酸中的一种或多种。 3.如权利要求1所述的人V9V 2T细胞扩增方法， 其特征在于， 所述步骤2中， 所述细胞 悬液的细胞密度为34106个/ml。 4.如权利要求1所述的人V9V 2T细胞扩增方法， 其特征在于， 所述步骤2中， 所述人V 9V 2T细胞刺激扩增培养基中， 膦酸类化合物的浓度为1-1000 M； 所述人V9V 2T细胞刺激扩增培养基与所述人V9V 2T细胞培养基中， 白介素-。
5、2的浓 度为1-1000ng/ml， 白介素-15的浓度为1-1000ng/ml， 维生素C的浓度为10 M-800mM。 5.如权利要求1所述的人V9V 2T细胞扩增方法， 其特征在于， 所述细胞培养容器为24 孔板、 48孔板或96孔板； 所述步骤3中， 将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中培养72小时； 所述步骤4的后续培养过程中， 每隔48-72小时对细胞进行换液。 6.一种人V9V 2T细胞培养基， 其特征在于， 包括基础培养基以及添加于所述基础培 养基中的白介素-2、 白介素-15以及维生素C。 7.如权利要求6所述的人V9V 2T细胞培养基， 其特征在于， 所述基础培养基为RPMI。
6、- 1640培养基。 8.如权利要求6所述的人V9V 2T细胞培养基， 其特征在于， 所述人V9V 2T细胞培养 基中， 白介素-2的浓度为1-1000ng/ml， 白介素-15的浓度为1-1000ng/ml， 维生素C的浓度为 10 M-800mM。 9.一种人V9V 2T细胞刺激扩增培养基， 其特征在于， 包括如权利要求6至8任一项所 述的人V9V 2T细胞培养基以及添加于所述人V9V 2T细胞培养基中的膦酸类化合物。 10.如权利要求9所述的人V9V 2T细胞刺激扩增培养基， 其特征在于， 所述人V9V 2T细胞刺激扩增培养基中， 膦酸类化合物的浓度为1-1000 M。 权利要求书 1/。
7、1 页 2 CN 109337870 A 2 人V9V 2T细胞扩增方法与培养基 技术领域 0001 本发明涉及细胞培养技术领域， 尤其涉及一种人V9V 2T细胞扩增方法与培养 基。 背景技术 0002 免疫细胞治疗已成为全世界医疗领域内对难治性疾病(如恶性肿瘤)进行治疗的 新的重要医疗手段， 比如采用CAR-T细胞对B细胞淋巴瘤进行治疗。 对科学界和医疗界而言， 获得质量稳定可靠、 功能优良的免疫细胞对获得良好的临床治疗效果非常关键。 0003 人V9V 2T细胞是仅存在于灵长类和人中的一类具有抗肿瘤、 抗感染功能的T细 胞亚群。 人V9V 2T细胞可用于患有肿瘤、 难治性传染病及免疫功能失。
8、衡疾病的人群的免 疫细胞治疗或免疫功能重建。 0004 目前对人V9V 2T细胞的扩增方法主要有两大类： 0005 第一类现有扩增技术是在外周血单核细胞(PBMCs)的培养基中添加IL-2和TCR 的单克隆抗体。 这种方法的主要缺点是外周血中的两类 T细胞(V 1细胞亚群和V 2细胞 亚群)都被扩增， 而V 1细胞亚群具有免疫抑制功能， 因此不适用于免疫细胞治疗。 0006 第二类现有扩增技术是在PBMCs的培养基中添加IL-2和磷酸盐小分子化合物如唑 来膦酸。 这种方法可以得到纯度较高的V 2亚群的 T细胞， 可以用于免疫细胞治疗， 这是 目前国内外扩增人外周血人V9V 2T细胞的常用方法。。
9、 但是该方法的缺点是： 细胞培养扩 增的周期为14天左右， 扩增出来的人V9V 2T细胞的存活时间较短(能继续存活7天左右)， 细胞抗凋亡能力不强， 对肿瘤细胞的杀伤能力不强等。 发明内容 0007 本发明的目的首先在于提供一种人V9V 2T细胞扩增方法， 能够提高人V9V 2T 细胞的增殖效率与细胞纯度， 培养得到的人V9V 2T细胞具有较强的肿瘤杀伤能力及抑制 能力， 同时抗凋亡能力较强， 细胞的存活时间较长。 0008 本发明的目的还在于提供一种人V9V 2T细胞培养基， 采用该培养基对人V9V 2T细胞进行培养， 能够提高人V9V 2T细胞的增殖效率与细胞纯度， 培养得到的人V9V 2。
10、T细胞具有较强的肿瘤杀伤能力及抑制能力， 同时抗凋亡能力较强， 细胞的存活时间较长。 0009 本发明的目的还在于提供一种人V9V 2T细胞刺激扩增培养基， 能够从外周血单 个核细胞中选择性的扩增出人V9V 2T细胞， 扩增得到的人V9V 2T细胞的纯度高， 杀伤 能力与抗凋亡能力较强。 0010 为实现以上目的， 本发明首先提供一种人V9V 2T细胞扩增方法， 包括： 0011 步骤1、 从人体外周血中提取外周血单个核细胞； 0012 步骤2、 提供人V9V 2T细胞刺激扩增培养基， 采用所述人V9V 2T细胞刺激扩增 培养基对所述外周血单个核细胞进行重悬， 得到细胞悬液； 0013 所述人。
11、V9V 2T细胞刺激扩增培养基包括人V9V 2T细胞培养基以及添加于所 说明书 1/8 页 3 CN 109337870 A 3 述人V9V 2T细胞培养基中的膦酸类化合物； 所述人V9V 2T细胞培养基包括基础培养基 以及添加于所述基础培养基中的白介素-2、 白介素-15以及维生素C； 0014 所述步骤1与步骤2的顺序可调； 0015 步骤3、 将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中培养60-100小时； 0016 步骤4、 采用所述人V9V 2T细胞培养基进行换液， 后续培养过程均采用所述人V 9V 2T细胞培养基进行。 0017 可选的， 所述基础培养基为RPMI-1640培养基； 所述膦。
12、酸类化合物包括唑来膦酸、 依替膦酸、 伊班膦酸、 帕米膦酸、 阿仑膦酸、 利塞膦酸、 米罗磷酸中的一种或多种。 0018 可选的， 所述步骤2中， 所述细胞悬液的细胞密度为34106个/ml。 0019 可选的， 所述步骤2中， 所述人V9V 2T细胞刺激扩增培养基中， 膦酸类化合物的 浓度为1-1000 M； 0020 所述人V9V 2T细胞刺激扩增培养基与所述人V9V 2T细胞培养基中， 白介素-2 的浓度为1-1000ng/ml， 白介素-15的浓度为1-1000ng/ml， 维生素C的浓度为10 M-800mM。 0021 可选的， 所述细胞培养容器为24孔板、 48孔板或96孔板； 。
13、所述步骤3中， 将所述细胞 悬液接种到细胞培养容器中培养72小时； 所述步骤4的后续培养过程中， 每隔48-72小时对 细胞进行换液。 0022 本发明还提供一种人V9V 2T细胞培养基， 包括基础培养基以及添加于所述基础 培养基中的白介素-2、 白介素-15以及维生素C。 0023 可选的， 所述基础培养基为RPMI-1640培养基。 0024 可选的， 所述人V9V 2T细胞培养基中， 白介素-2的浓度为1-1000ng/ml， 白介素- 15的浓度为1-1000ng/ml， 维生素C的浓度为10 M-800mM。 0025 本发明还提供一种人V9V 2T细胞刺激扩增培养基， 包括人V9V。
14、 2T细胞培养基 以及添加于所述人V9V 2T细胞培养基中的膦酸类化合物。 0026 可选的， 所述人V9V 2T细胞刺激扩增培养基中， 膦酸类化合物的浓度为1-1000 M。 0027 本发明的有益效果： 0028 (1)与传统的扩增方法(第二类扩增技术)相比， 本发明的扩增方法中人V9V 2T 细胞的增殖效率更快且细胞纯度更高， 在(从步骤3开始)培养10-12天时， 即可达到90的 细胞纯度， 细胞扩增比率达到1000倍以上(即能够将10万个人V9V 2T细胞扩增至至少一 亿个人V9V 2T细胞)， 显著缩短了人V9V 2T细胞扩增培养周期； 0029 (2)与传统的扩增方法(第二类扩增。
15、技术)得到的人V9V 2T细胞相比， 本发明扩 增得到的人V9V 2T细胞对肿瘤的杀伤及抑制能力更强； 0030 (3)本发明扩增得到的人V9V 2T细胞的抗凋亡能力更强， 存活时间更长， 并且， 在细胞扩增培养周期(从步骤3开始10-12天)结束后， 本发明扩增得到的人V9V 2T细胞能 继续存活约20天。 附图说明 0031 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案， 下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍， 应当理解， 以下附图仅示出了本发明的某些实施例， 因此不应被看作是对 说明书 2/8 页 4 CN 109337870 A 4 本发明范围的限定。 0032 图1为采用四种不同。
16、的培养基对人V9V 2T细胞进行扩增培养的增殖效率对比 图； 0033 图2为采用四种不同的培养基对人V9V 2T细胞进行扩增培养后得到的人V9V 2T细胞的凋亡率对比图； 0034 图3为采用四种不同的培养基对人V9V 2T细胞进行扩增培养后得到的人V9V 2T细胞的关键杀伤分子NKG2D表达水平对比图； 0035 图4A为采用传统的扩增方法(IL2)得到的人V9V 2T细胞对肺癌人源化小鼠进行 细胞治疗后的肿瘤大小示意图； 0036 图4B为采用本发明的扩增方法(IL2+IL15+VC)得到的人V9V 2T细胞对肺癌人源 化小鼠进行细胞治疗后的肿瘤大小示意图； 0037 图4C为在未经治疗。
17、的情况下肺癌人源化小鼠的肿瘤大小示意图； 0038 图5为在不同的治疗情况下肺癌人源化小鼠的肿瘤体积变化示意图； 0039 图6为在不同的治疗情况下肺癌人源化小鼠的存活率变化示意图。 具体实施方式 0040 如本文所用之术语： 0041 “由制备” 与 “包含” 同义。 本文中所用的术语 “包含” 、“包括” 、“具有” 、“含有” 或其任何其它变形， 意在覆盖非排它性的包括。 例如， 包含所列要素的组合物、 步骤、 方法、 制品或装置不必仅限于那些要素， 而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、 步 骤、 方法、 制品或装置所固有的要素。 0042 连接词 “由组成” 排除任何未指出的。
18、要素、 步骤或组分。 如果用于权利要求中， 此短语将使权利要求为封闭式， 使其不包含除那些描述的材料以外的材料， 但与其相关的 常规杂质除外。 当短语 “由组成” 出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后 时， 其仅限定在该子句中描述的要素； 其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之 外。 0043 当量、 浓度、 或者其它值或参数以范围、 优选范围、 或一系列上限优选值和下限优 选值限定的范围表示时， 这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围 下限或优选值的任一配对所形成的所有范围， 而不论该范围是否单独公开了。 例如， 当公开 了范围 “15” 时， 所描述的范围。
19、应被解释为包括范围 “14” 、“13” 、“12” 、“12和4 5” 、“13和5” 等。 当数值范围在本文中被描述时， 除非另外说明， 否则该范围意图包括其端 值和在该范围内的所有整数和分数。 0044 “质量份” 指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位， 1份可表示任意的单 位质量， 如可以表示为1g， 也可表示2.689g等。 假如我们说A组分的质量份为a份， B组分的质 量份为b份， 则表示A组分的质量和B组分的质量之比a： b。 或者， 表示A组分的质量为aK， B组 分的质量为bK(K为任意数， 表示倍数因子)。 不可误解的是， 与质量份数不同的是， 所有组分 的质量份之和。
20、并不受限于100份之限制。 0045 “和/或” 用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生， 例如， A和/或B包括(A 和B)和(A或B)； 说明书 3/8 页 5 CN 109337870 A 5 0046 此外， 本发明要素或组分前的不定冠词 “一种” 和 “一个” 对要素或组分的数量要求 (即出现次数)无限制性。 因此 “一个” 或 “一种” 应被解读为包括一个或至少一个， 并且单数 形式的要素或组分也包括复数形式， 除非所述数量明显旨指单数形式。 0047 本发明首先提供一种人V9V 2T细胞扩增方法， 包括： 0048 步骤1、 从人体外周血中提取外周血单个核细胞(PBMC)。 。
21、0049 步骤2、 提供人V9V 2T细胞刺激扩增培养基， 采用所述人V9V 2T细胞刺激扩增 培养基对所述外周血单个核细胞进行重悬， 得到细胞悬液； 0050 所述人V9V 2T细胞刺激扩增培养基包括人V9V 2T细胞培养基以及添加于所 述人V9V 2T细胞培养基中的膦酸类化合物； 所述人V9V 2T细胞培养基包括基础培养基 以及添加于所述基础培养基中的白介素-2(IL-2)、 白介素-15(IL-15)以及维生素C (Vitamin C)。 0051 所述步骤1与步骤2的顺序可调。 0052 步骤3、 将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中培养60-100小时。 0053 步骤4、 采用所述人。
22、V9V 2T细胞培养基进行换液， 后续培养过程均采用所述人V 9V 2T细胞培养基进行。 0054 具体的， 所述步骤1中， 所述基础培养基为RPMI-1640培养基。 RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写， 代指洛斯维帕克纪念研究所。 RPMI是该研究所研发的一类 细胞培养基， 1640是培养基代号， 其中含有10胎牛血清。 0055 可选的， 所述膦酸类化合物包括唑来膦酸(Zoledronate,ZOL)、 依替膦酸、 伊班膦 酸、 帕米膦酸、 阿仑膦酸、 利塞膦酸、 米罗磷酸中的一种或多种。 0056 在本发明的一实施例中， 所述膦酸类化合物为唑。
23、来膦酸。 0057 具体的， 所述步骤2中， 所述细胞悬液的细胞密度为34106个/ml。 0058 具体的， 所述步骤2与步骤3的目的在于： 通过采用含有膦酸类化合物的人V9V 2T细胞刺激扩增培养基对所述外周血单个核细胞进行培养， 选择性的对所述外周血单个核 细胞中的V9V 2T细胞进行扩增， 并且抑制其它细胞的生长， 使其它细胞凋亡。 0059 可选的， 所述细胞培养容器为24孔板、 48孔板或96孔板。 0060 所述步骤4的目的在于对所述步骤3选择性扩增出的纯度较高的V9V 2T细胞进 行进一步扩增， 以增加V9V 2T细胞的数量。 0061 具体的， 所述步骤2中， 所述人V9V 。
24、2T细胞刺激扩增培养基中， 膦酸类化合物的 浓度为1-1000 M； 0062 所述人V9V 2T细胞刺激扩增培养基与所述人V9V 2T细胞培养基中， 白介素-2 的浓度为1-1000ng/ml， 白介素-15的浓度为1-1000ng/ml， 维生素C的浓度为10 M-800mM。 0063 优选的， 所述步骤3中， 将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中培养72小时。 0064 具体的， 所述步骤4的后续培养过程中， 每隔48-72小时对细胞进行换液。 0065 具体的， 所述步骤3与步骤4的总培养时间通常为10-12天， 这个时间点的细胞数量 充足并且杀伤能力最强， 尤其适用于进行细胞治疗。 。
25、0066 本发明的人V9V 2T细胞扩增方法中， 未注明具体条件的操作方法均按常规条件 (如 精编分子生物学实验指南 (F.M.奥斯伯， R.E.金斯顿， J.G.塞德曼等主编， 马学军， 舒 跃龙的译.北京： 科学出版社， 2004)中所述的方法进行。 说明书 4/8 页 6 CN 109337870 A 6 0067 本发明的关键技术特征在于在细胞培养过程中白介素-15和维生素C的使用， 通过 在人V9V 2T细胞的扩增培养过程中添加白介素-15和维生素C， 与传统的扩增方法(第二 类扩增技术)相比， 能够提高人V9V 2T细胞的增殖效率与细胞纯度， 培养得到的人V9V 2T细胞的抗凋亡能。
26、力更强， 细胞存活时间更长， 并且关键杀伤分子NKG2D的表达水平更高， 从而对肿瘤细胞的杀伤能力更强。 相对于现有的第二类扩增技术(详见背景技术介绍)来 说， 本发明解决了比如扩增效率低及纯度低的问题、 所获得细胞的杀伤功能不强的问题以 及所获得细胞存活时间不够、 易衰老、 易凋亡等技术问题。 0068 总的来说， 本发明的人V9V 2T细胞扩增方法的有益效果包括： 0069 (1)与传统的扩增方法(第二类扩增技术)相比， 本发明的扩增方法中人V9V 2T 细胞的增殖效率更快且细胞纯度更高， 在(从步骤3开始)培养10-12天时， 即可达到90的 细胞纯度， 细胞扩增比率达到1000倍以上(。
27、即能够将10万个人V9V 2T细胞扩增至至少一 亿个人V9V 2T细胞)， 显著缩短了人V9V 2T细胞扩增培养周期； 0070 (2)与传统的扩增方法(第二类扩增技术)得到的人V9V 2T细胞相比， 本发明扩 增得到的人V9V 2T细胞对肿瘤的杀伤及抑制能力更强； 0071 (3)本发明扩增得到的人V9V 2T细胞的抗凋亡能力更强， 存活时间更长， 并且， 在细胞扩增培养周期(从步骤3开始10-12天)结束后， 本发明扩增得到的人V9V 2T细胞能 继续存活约20天。 0072 基于上述人V9V 2T细胞扩增方法， 本发明还提供一种人V9V 2T细胞培养基， 包括基础培养基以及添加于所述基础。
28、培养基中的白介素-2、 白介素-15以及维生素C。 0073 可选的， 所述基础培养基为RPMI-1640培养基。 0074 可选的， 所述人V9V 2T细胞培养基中， 白介素-2的浓度为1-1000ng/ml， 白介素- 15的浓度为1-1000ng/ml， 维生素C的浓度为10 M-800mM。 0075 本发明还提供一种人V9V 2T细胞刺激扩增培养基， 包括如上文所述的人V9V 2T细胞培养基以及添加于所述人V9V 2T细胞培养基中的膦酸类化合物。 0076 可选的， 所述人V9V 2T细胞刺激扩增培养基中， 膦酸类化合物的浓度为1-1000 M。 0077 图1为采用四种不同的培养基。
29、对人V9V 2T细胞进行扩增培养的增殖效率对比 图。 0078 图1中， IL2表示整个扩增培养过程中采用的是在基础培养基的基础上添加IL2+ IL15后得到的培养基； 0079 IL2+VC表示整个扩增培养过程中采用的是在基础培养基的基础上添加IL2+VC后 得到的培养基； 0080 IL2+IL15表示整个扩增培养过程中采用的是在基础培养基的基础上添加IL2+ IL15后得到的培养基； 0081 IL2+IL15+VC表示整个扩增培养过程中采用的是在基础培养基的基础上添加IL2+ IL15+VC后得到的培养基； 0082 在前期的刺激扩增阶段(步骤2与步骤3)， 上述四种培养基方案中均添加。
30、ZOL。 0083 如图1所示， 采用上述四种培养基分别对人V9V 2T细胞进行扩增培养后， 得到的 数据显示， 没有添加IL15的培养基(IL2与IL2+VC)的细胞增殖效率较低， 而添加了IL15的培 说明书 5/8 页 7 CN 109337870 A 7 养基(IL2+IL15与IL2+IL15+VC)的细胞增殖效率较高， 由此可以看出， IL-15的添加能够显 著提高人V9V 2T细胞的增殖效率(Ki67蛋白表达上升)。 0084 图2为采用四种不同的培养基对人V9V 2T细胞进行扩增培养后得到的人V9V 2T细胞的凋亡率对比图， 图2中IL2、 IL2+VC、 IL2+IL15、 。
31、IL2+IL15+VC表示的含义与图1相同。 0085 从图2中可以看出， 在培养基中添加VC能够显著降低细胞的凋亡比例和凋亡速度， 另外， IL-15与VC联用能够更加显著的增强细胞抗凋亡能力。 0086 图3为采用四种不同的培养基对人V9V 2T细胞进行扩增培养后得到的人V9V 2T细胞的关键杀伤分子NKG2D表达水平对比图， 图3中IL2、 IL2+VC、 IL2+IL15、 IL2+IL15+VC 表示的含义与图1、 图2相同。 0087 从图3中可以看出， IL-15与维生素C的联用能够使人V9V 2T细胞的关键杀伤分 子NKG2D持续维持高水平表达， 并且在培养21天及以后仍然维持。
32、在高水平表达。 换言之， IL- 15与VC联用的配方(即本发明的技术方案)能够使人V9V 2T细胞的高杀伤能力维持更长 时间。 0088 肿瘤治疗实验： 0089 本实验为治疗模型， 首先构建人源化小鼠， 即在小鼠体内构建人的外周免疫系统， 从而模拟人体生理状态。 然后将10万个A549癌细胞通过皮下注射至小鼠体内， 待肿瘤细胞 生长7天， 在小鼠体内长出肿瘤。 然后利用培养好的人V9V 2T细胞进行治疗， 每三天通过 尾静脉注射细胞治疗一次， 连续治疗5次， 每次打细胞数量为5*106个细胞， 然后定期观察 小鼠的肿瘤生长情况， 并记录小鼠的存活率。 总观察时间为90天， 之后按伦理要求处。
33、死小 鼠， 取肿瘤块进行测量、 分析等。 0090 肿瘤治疗实验的结果如图4A、 图4B、 图4C、 图5以及图6所示。 0091 图4A为采用传统的扩增方法(IL2)得到的人V9V 2T细胞对肺癌人源化小鼠进行 细胞治疗后的肿瘤大小示意图。 0092 所述传统的扩增方法(即第二类扩增技术)即为在基础培养基中始终加入IL2进行 培养， 并且在培养的前期阶段添加ZOL进行刺激性扩增。 0093 图4B为采用本发明的扩增方法(IL2+IL15+VC)得到的人V9V 2T细胞对肺癌人源 化小鼠进行细胞治疗后的肿瘤大小示意图。 0094 图4C为在未经治疗的情况下肺癌人源化小鼠的肿瘤大小示意图。 00。
34、95 图4A、 图4B、 图4C的实验中使用的肺癌人源化小鼠为肿瘤类型相同、 肿瘤体积基本 相同的小鼠， 并且图4A、 图4B、 图4C中展示的肿瘤的生长时间相同。 0096 通过对4A、 图4B、 图4C进行对比可以看出， 采用本发明的扩增方法得到的人V9V 2T细胞对肺癌人源化小鼠进行细胞治疗后， 证明与传统的扩增方法得到的人V9V 2T细胞 相比， 本发明扩增得到的人V9V 2T细胞能够更加有效的抑制肺癌细胞的生长(肿瘤的体 积明显缩小)， 并且能够显著提高肺癌人源化小鼠的生存率。 在第42天时， 采用传统的扩增 方法得到的人V9V 2T细胞进行细胞治疗的肺癌人源化小鼠以及未经治疗的肺癌。
35、人源化 小鼠已全部死亡， 而采用本发明的扩增方法得到的人V9V 2T细胞进行细胞治疗的肺癌人 源化小鼠全部存活， 存活率为100， 并且其中一只小鼠的肿瘤完全消失(图4B方框所示)。 0097 图5为在不同的治疗情况下肺癌人源化小鼠的肿瘤体积变化示意图， 图5分别展示 了采用传统的扩增方法(IL2)得到的人V9V 2T细胞对肺癌人源化小鼠进行细胞治疗、 采 说明书 6/8 页 8 CN 109337870 A 8 用本发明的扩增方法(IL2+IL15+VC)得到的人V9V 2T细胞对肺癌人源化小鼠进行细胞治 疗以及未经治疗的肺癌人源化小鼠的肿瘤体积变化情况。 0098 可以看出， 随着时间的增。
36、加， 采用传统的扩增方法(IL2)得到的人V9V 2T细胞治 疗的肺癌人源化小鼠以及未经治疗的肺癌人源化小鼠的肿瘤体积不断增加并且在后期肿 瘤体积增加速度非常快， 而采用本发明的扩增方法(IL2+IL15+VC)得到的人V9V 2T细胞 治疗的肺癌人源化小鼠的肿瘤体积的增加速度非常缓慢， 也即是说， 与传统的扩增方法 (IL2)得到的人V9V 2T细胞相比， 本发明的扩增方法(IL2+IL15+VC)得到的人V9V 2T细 胞对肿瘤的体内生长具有更强的抑制作用， 使得肿瘤体积更小。 0099 图6为在不同的治疗情况下肺癌人源化小鼠的存活率变化示意图， 图6分别展示了 采用传统的扩增方法(IL2。
37、)得到的人V9V 2T细胞对肺癌人源化小鼠进行细胞治疗、 采用 本发明的扩增方法(IL2+IL15+VC)得到的人V9V 2T细胞对肺癌人源化小鼠进行细胞治疗 以及未经治疗的肺癌人源化小鼠的存活率变化情况。 0100 可以看出， 随着时间的增加， 采用传统的扩增方法(IL2)得到的人V9V 2T细胞治 疗的肺癌人源化小鼠以及未经治疗的肺癌人源化小鼠的存活率下降非常快， 采用本发明的 扩增方法(IL2+IL15+VC)得到的人V9V 2T细胞治疗的肺癌人源化小鼠的存活率一直为 100， 也即是说， 采用本发明的扩增方法(IL2+IL15+VC)得到的人V9V 2T细胞能够显著 提高肺癌人源化小鼠。
38、的生存率。 0101 下面以具体实施例的形式对本发明的人V9V 2T细胞培养基与人V9V 2T细胞 刺激扩增培养基进行详细描述。 0102 实施例1 0103 该实施例1提供一种人V9V 2T细胞培养基， 包括RPMI-1640培养基以及添加于所 述RPMI-1640培养基中的白介素-2、 白介素-15以及维生素C。 0104 其中， 所述人V9V 2T细胞培养基中， 白介素-2的浓度为300ng/ml， 白介素-15的 浓度为500ng/ml， 维生素C的浓度为100mM。 0105 实施例2 0106 该实施例2提供一种人V9V 2T细胞培养基， 包括RPMI-1640培养基以及添加于所 。
39、述RPMI-1640培养基中的白介素-2、 白介素-15以及维生素C。 0107 其中， 所述人V9V 2T细胞培养基中， 白介素-2的浓度为500ng/ml， 白介素-15的 浓度为700ng/ml， 维生素C的浓度为300mM。 0108 实施例3 0109 该实施例3提供一种人V9V 2T细胞刺激扩增培养基， 包括如实施例1所述的人V 9V 2T细胞培养基以及添加于所述人V9V 2T细胞培养基中的唑来膦酸。 0110 其中， 所述人V9V 2T细胞刺激扩增培养基中， 唑来膦酸的浓度为300 M。 0111 实施例4 0112 该实施例4提供一种人V9V 2T细胞刺激扩增培养基， 包括如实。
40、施例2所述的人V 9V 2T细胞培养基以及添加于所述人V9V 2T细胞培养基中的唑来膦酸。 0113 其中， 所述人V9V 2T细胞刺激扩增培养基中， 唑来膦酸的浓度为500 M。 0114 由于本发明中所涉及的各工艺参数的数值范围在上述实施例中不可能全部体现， 但本领域的技术人员完全可以想象到只要落入上述该数值范围内的任何数值均可实施本 说明书 7/8 页 9 CN 109337870 A 9 发明， 当然也包括若干项数值范围内具体值的任意组合。 此处， 出于篇幅的考虑， 省略了给 出某一项或多项数值范围内具体值的实施例， 此不应当视为本发明的技术方案的公开不充 分。 0115 申请人声明，。
41、 本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程， 但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程， 即不意味着本发明必须依赖上述详细 工艺设备和工艺流程才能实施。 所属技术领域的技术人员应该明了， 对本发明的任何改进， 对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、 具体方式选择等， 落在本发明的保护 范围内。 说明书 8/8 页 10 CN 109337870 A 10 图1 图2 说明书附图 1/4 页 11 CN 109337870 A 11 图3 图4A 图4B 说明书附图 2/4 页 12 CN 109337870 A 12 图4C 图5 说明书附图 3/4 页 13 CN 109337870 A 13 图6 说明书附图 4/4 页 14 CN 109337870 A 14 。