本申请公开了一种提升细胞扩增速率的方法，包括：获得稳转细胞株后，对所述稳转细胞株进行多次的筛选处理；其中，筛选处理包括如下步骤：对稳转细胞株进行预培养，取第一预定体积的预培养得到的细胞培养液进行静置预定时间，从静置后的细胞培养液的靠近液面的区域取出第二预定体积的液体，即细胞筛选液，将细胞筛选液扩培至第三预定体积，得到细胞扩培液；其中，细胞扩培液用于进行生产培养或用于进行下一轮的筛选处理。根据本申请，能够从细胞自身出发，通过改善结团现象来改善细胞群体扩增速率。
1.一种提升细胞扩增速率的方法，其特征在于，包括：获得稳转细胞株后，对所述稳转
其中，所述筛选处理包括如下步骤：对所述稳转细胞株进行预培养，取第一预定体积的
预培养得到的细胞培养液进行静置预定时间，从静置后的细胞培养液的靠近液面的区域取
出第二预定体积的液体，即细胞筛选液，将所述细胞筛选液扩培至第三预定体积，得到细胞
2.根据权利要求1所述的提升细胞扩增速率的方法，其特征在于，所述稳转细胞株的细
胞类型为CHO细胞、HEK293细胞、SF9细胞、NS0细胞和BHK‑21细胞的其中一种。
3.根据权利要求1所述的提升细胞扩增速率的方法，其特征在于，所述筛选处理的次数
4.根据权利要求1所述的提升细胞扩增速率的方法，其特征在于，所述预定时间为1至2
5.根据权利要求4所述的提升细胞扩增速率的方法，其特征在于，所述预定时间为1.5
6.根据权利要求1所述的提升细胞扩增速率的方法，其特征在于，所述第二预定体积为
7.根据权利要求6所述的提升细胞扩增速率的方法，其特征在于，所述第三预定体积为
8.根据权利要求1所述的提升细胞扩增速率的方法，其特征在于，从静置后的细胞培养
9.根据权利要求8所述的提升细胞扩增速率的方法，其特征在于，从静置后的细胞培养
10.根据权利要求1所述的提升细胞扩增速率的方法，其特征在于，所述预培养后还包
[0001]本申请涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种提升细胞倍增速率的方法。
[0002]细胞培养是生产目的蛋白的重要方法之一，被广泛用于医药研究、生物技术和制
药工业中。通常流程为，先选择合适的宿主细胞，然后将目标基因导入到宿主细胞内，获得
能够稳定表达目标基因的细胞株，也即稳转细胞株；随后，再对稳转细胞株给予适合的培养
基和生长条件进行细胞培养；培养一段时间后，可以通过收获和提取等步骤来获得细胞所
[0003]宿主细胞作为是生物大分子药物生产的工厂，宿主细胞的生长状态，表达蛋白的
能力，扩增的速度等条件都会影响最终的产量和质量。获得稳转细胞株后，需要进行大规模
扩培，以达到大罐反应器的接种密度，因此细胞往往需要累计扩增很多代次。但在细胞的长
期培养过程中，会伴随着搅拌带来的机械损伤，且细胞在快速扩增的过程中也不免会积累
一些突变，随着细胞代次的增加，损伤或者突变积累到一定程度，会产生细胞结团等现象，
[0004]目前，通常是通过对细胞培养工艺和蛋白纯化工艺进行优化，通过对整个细胞培
养的过程加强控制，来尽可能减少细胞长期培养后产量降低且倍增速率降低的情况的发
生，也即是在原稳转细胞株的基础上对培养工艺进行优化。然而，受限于原有稳转细胞株的
特性，对于细胞在长期培养过程中突变或损伤积累导致细胞扩增速率下降问题的可优化空
本申请的一方面公开了一种提升细胞扩增速率的方法，包括：获得稳转细胞株后，
对所述稳转细胞株进行多次的筛选处理；其中，所述筛选处理包括如下步骤：对所述稳转细
胞株进行预培养，取第一预定体积的预培养得到的细胞培养液进行静置预定时间，从静置
后的细胞培养液的靠近液面的区域取出第二预定体积的液体，即细胞筛选液，将所述细胞
筛选液扩培至第三预定体积，得到细胞扩培液；其中，所述细胞扩培液用于进行下一次的所
[0007]需要说明的是，稳转细胞株指经过基因转染或遗传工程技术处理后，在细胞中稳
定表达外源基因的细胞系。细胞结团是大体积培养中明显影响细胞倍增速率的一个因素，
本申请主要针对改善结团现象来改善细胞群体扩增速率。本申请在稳转细胞株开始大规模
扩培之前，先通对稳转细胞株本身进行筛选，改善细胞群体的组成。具体而言，对预培养得
到的细胞培养液进行静置预定时间后，结团的细胞更容易下沉，未结团的细胞则主要更靠
近液面，将这部分取出进行扩培，随后再进行重复的筛选。经过多次的筛选处理，能够不断
提高不易结团的细胞的比例，不断降低易结团的细胞的比例，由此能够从稳转细胞株本身
[0009]还需要说明的是，细胞扩培是指将细胞从一个生长容器（例如培养皿）中收获，并
重新分散到一个或多个新的生长容器中，以支持其持续生长和繁殖的过程。通过扩培，可以
[0010]本申请的一种实现方式中，所述稳转细胞株的细胞类型为CHO细胞、HEK293细胞、
[0012]需要说明的是，筛选次数为2是指，取第一预定体积的细胞扩培液进行静置预定时
间后，从靠近液面处取出第二预定体积的液体进行扩培至第三预定体积。筛选次数为3是
指，在第二次筛选的基础上，取第一预定体积的细胞扩培液进行静置预定时间后，从靠近液
[0013]还需要说明的是，虽然从理论上来说，筛选处理的次数越多，能够富集得到更高比
例的不易结团的细胞但是，筛选次数达到一定数量后，其效果会到达一个平台期，也即其效
果增加的会比较有限，且对稳转细胞株进行筛选处理需要耗费时间，如果筛选次数较多，会
增加时间、人力等一系列成本，进而会无法满足生产工期和生产效率的要求。本申请中，优
[0014]本申请的一种实现方式中，所述预定时间为1至2小时。在这种情况下，能够较好的
分层效果，可以理解，静置时间较短，分层效果不明显，静置时间较长，则可能影响细胞活
[0016]本申请的一种实现方式中，所述第二预定体积为所述第一预定体积的1/10至1/4。
[0017]本申请星空体育 星空体育平台的一种实现方式中，所述第三预定体积为所述第二预定体积的50至200倍。
由此，在筛选阶段进行较小规模的扩培，细胞的遗传物质较为稳定，不会积累过多的突变或
[0018]本申请的一种实现方式中，从静置后的细胞培养液的靠近液面的1/4至1/6区域处
取出所述第二预定体积的液体。由此，能够选取不易结团的细胞比例较多的区域进行取样。
[0019]本申请的一种实现方式中，从静置后的细胞培养液的靠近液面的1/5区域处取出
[0020]本申请的一种实现方式中，所述预培养后还包括对所述细胞培养液进行搅拌，搅
拌速度为10至100转/分钟。由此，能够对预培养得到的细胞培养液进行低速搅拌，以便于后
[0022]下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多
细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识
到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些
情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的
核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不
是必要的，根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
[0023]另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各
种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易
见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施
[0024]本文中，数值范围的描述包括端点以及范围内的任意数值，例如“1至10”或“1‑10”
[0025]通常，获得稳转细胞株后，需要进行大规模扩培，以达到大罐反应器的接种密度，
因此细胞往往需要累计扩增很多代次。但在细胞的长期培养过程中，会伴随着搅拌带来的
机械损伤，且细胞在快速扩增的过程中也不免会积累一些突变，随着细胞代次的增加，损伤
或者突变积累到一定程度，会产生细胞结团等现象，进而导致细胞扩增速率下降，同时产品
[0026]本申请创造性地通过对稳转细胞株进行筛选处理，能够通过筛选处理对不易结团
的细胞进行富集，进而能够从细胞自身来提升细胞扩增的速率。需要说明的是，本申请星空体育 星空体育平台通过
筛选的参数进行了大量的测试，最终得出经过自然沉降、取出上层细胞悬液进行小规模扩
培的方式作为一轮筛选处理，操作简便，能够取得良好的筛选效果。此外，本申请通过对多
个静置时间、静置后取样区域（或取样高度）进行了大量试验，计算不同静置时间和取样区
域中的细胞结团率和细胞回收率，并对筛选处理环节中的扩培倍数进行测试，由此得到本
[0027]在一具体实施例中，本申请涉及一种提升细胞扩增速率的方法，包括：获得稳转细
[0028]在一具体实施例中，筛选处理包括如下步骤：对稳转细胞株进行预培养，取第一预
定体积的预培养得到的细胞培养液进行静置预定时间，从静置后的细胞培养液的靠近液面
的区域取出第二预定体积的液体，即细胞筛选液，将细胞筛选液扩培至第三预定体积，得到
[0029]在一具体实施例中，筛选处理的次数为2至4次。例如，筛选处理的次数可以为2次、
3次或4次。需要说明的是，筛选次数为2是指，取第一预定体积的细胞扩培液进行静置预定
时间后，从靠近液面处取出第二预定体积的液体进行扩培至第三预定体积。筛选次数为3是
指，在第二次筛选的基础上，取第一预定体积的细胞扩培液进行静置预定时间后，从靠近液
[0030]在一具体实施例中，稳转细胞株的细胞类型可以包括但不限于CHO细胞、HEK293细
[0031]在一具体实施例中，目的蛋白可以包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、非Fc
[0032]在一具体实施例中，预培养可以通过使用常规的生长培养基进行培养。
[0033]在一具体实施例中，预培养过程中或预培养后，可以对细胞培养液进行缓慢搅拌。
其中，搅拌速度可以为10至100转/分钟。由此，能够对预培养得到的细胞培养液进行低速搅
[0034]在一具体实施例中，预定时间可以为1至2小时。例如，预定时间可以为1小时、1.2
小时、1.5小时、1.7小时或2小时。优选地，预定时间为1.5小时。可以理解，静置时间较短，分
层效果不明显，静置时间较长，则可能影响细胞活性，本申请中静置时间为1至2小时，能够
[0035]本申请的一种实现方式中，可以在20℃至30℃的条件下进行静置。优选地，在室温
[0036]在一具体实施例中，第二预定体积为第一预定体积的1/10至1/4。例如，第二预定
[0037]在一具体实施例中，第三预定体积为第二预定体积的50至200倍。例如，第三预定
[0038]本申请的一种实现方式中，从静置后的细胞培养液的靠近液面的1/4至1/6区域处
取出所述第二预定体积的液体。优选地，从静置后的细胞培养液的靠近液面的1/5区域处取
出所述第二预定体积的液体。由此，能够选取不易结团的细胞比例较多的区域进行取样。
[0039]在一具体实施例中，对稳转细胞株完成筛选之后，可以进行大规模扩培。在一具体
[0040]下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进
[0041]需要说明的是，如无特别说明，本实施例中所用的试剂、原料、仪器均为普通市售，
[0042]稳转细胞株：为表达PD‑1的CHO‑K1Q细胞系（购自：中山康晟（QuaCell），货号：
稳转细胞株预培养：细胞株以5×10cells/mL的密度接种在30ml的摇瓶中，使用
原细胞株供应商配套的CO04培养基，置于二氧化碳的浓度为8%的37℃恒温摇床中培养。扩
培两次约6天后，细胞的量扩增了约100倍，细胞活率良好，密度在4‑6×10cells/mL，活率
[0043]取样：将预培养结束后的细胞培养液分装至15mL的BD管中，每管5mL。在常温下静
置1.5小时后，取液面到液面下方约1厘米处的1mL细胞培养液。获得的细胞悬液合并后为此
[0044]扩培：将取得的细胞悬液使用CD04培养基，置于二氧化碳的浓度为8%的37℃恒温
[0045]通过上述的预培养、取样和扩培作为一轮筛选，将筛选得到的细胞进行下一轮的
筛选。反复多次筛选直至在合适的时间范围内达到细胞结团率降低、细胞扩增速率提升的
然后，将筛选后的细胞用以5×10cells/mL的密度接种，在CD04培养基，置于二氧
化碳的浓度为8%的37℃恒温摇床中进行培养，并对细胞密度进行监测。同时将细胞以5×
10cells/mL的密度接种在30ml的摇瓶中，置于二氧化碳的浓度为8%的37℃恒温摇床中进
行流加培养，监测细胞在补糖补料的条件下生长至峰密度时的结团率。其中，实施例1为对
稳转细胞株进行了一轮筛选，实施例2为对稳转细胞株进行了两轮筛选，实施例3为对稳转
细胞株进行了三轮筛选，实施例4为对稳转细胞株进行了四轮筛选。下表为实施例1、实施例
综上可知，通过对稳转细胞株进行筛选处理，能够降低细胞峰密度时的结团率，提
[0047]以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申
请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱
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